Серологическая индикация и идентификация морганелл

Реакция аг­глютинации.Ускоренная индикация морганелл в реакции нейтрализации антител (РНАт). Морганеллы имеют соматический
О- и жгутиковый Н-антигены. У от­дельных штаммов обнаружено наличие поверхностного К-антигена.

О-антиген является полисахаридо-липидо-протеиновым комплексом, тер­мостабилен (выдерживает прогревание при 100° С в течение 2,5 часов и автоклавирование при 121° С, т.е. 1 атм. в течение 1 часа). По О-антигену в Классификационной антигенной схеме Рауса-Вороса к 1980 году насчиты­валось 47 серологических групп морганелл. Однако этот перечень не охва­тывает всего многообразия серогрупп данных бактерий, и к настоящему времени он существенно расширен.

Н-антиген является белком, термолабилен. Прогревание при 100° С при­водит к быстрому разрушению жгутикового антигена и утрате им агглютинабельных свойств. Кипячение культуры в течение 2,5 часов вызывает по­терю ее Н-агглютиногенных свойств.

К-антиген является поверхностным, термолабильным полисахаридным комплексом, сходным по составу с В-антигеном эшерихий, но при этом не препятствует агглютинации клеток специфическими
О-сыворотками.

Совокупность названных антигенов определяет серовариант М. niorganii. Серогрупповую принадлежность морганелл устанавливают в реакции агглютинации со специфическими О-сыворотками. При этом до пускается использование как живой, так и инактивированной культуры. Серовариант, при необходимости, устанавливают с помощью дополнитель­ной постановки РА с К- и Н-агглютинирующими сыворотками. При этом в качестве антигена используют только живые культуры.

Патогенность изучаемых культур морганелл устанавливают по их при­надлежности к серологическим группам, наиболее часто вызывающим ди­арею у молодняка сельскохозяйственных животных. С этой целью исполь­зуют набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих се-рогрупповых к 8 серологическим группам: 0l; 016; 026; 029; 033; 045; 049 и «13».

Исследования начинают с постановки пластинчатой РА с каждой из серогрупповых сывороток, входящих в набор. Антиген для РА готовят из 18-24-часовой агаровой культуры, которую смывают стерильным физи­ологическим раствором (3-4 см³ на 1 пробирку культуры на скошенном МП А). Суспензию прогревают при 100° С в водяной бане в течение 10 -15 мин, центрифугируют 20 мин при 3-5 тыс. об/мин, после чего большую часть надосадочной жидкости удаляют и утилизируют, а меньшую часть (1-1,5 см³) смешивают с осадком и используют в качестве антигена в пла­стинчатой РА.

Для постановки пластинчатой РА сыворотки разводят 1:10 в стериль­ном физиологическом растворе и каждую из них по капле наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Во все капли сывороток вносят и хорошо размешивают бактериологической петлей антиген. Результаты реакции учи­тывают при комнатной температуре в течение 3 мин. Положительная реак­ция характеризуется образованием зерен агглютината и полным просвет­лением жидкости. При отрицательной — агглютинат не образуется, жид­кость остается мутной. Возможна сомнительная реакция, при которой об­разуется незначительное количество зерен (хлопьев) агглютината, но жид­кость остается слабо-мутной.

При наличии положительной реакции на стекле с одной и более серогрупповыми сыворотками ставят развернутую пробирочную РА с этими сыворотками. Оставшийся после пластинчатой РА антиген (или приготов­ленный заново по вышеуказанной методике) разводят физиологическим ра­створом до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 см³ по оптическо­му стандарту мутности и используют для постановки развернутой РА в про­бирках.

Из серогрупповых сывороток готовят исходные разведения 1:50 в карболинизированном физиологическом растворе (0,5% фенола). Для этого 0,1 см³ нативной сыворотки смешивают с 4,9 см³ карболинизированного физиологического раствора либо 0,5 см³ сыворотки, разведенной 1:10, сме­шивают с 2 см³ карболинизированного физиологического раствора. Из ис­ходного разведения готовят двукратные разведения сыворотки от 1:100 до 0 — титров, указанных на этикетках флаконов с гомологичными сыворот ками. В подготовленный ряд пробирок с 0,5 см³ разведенных сывороток пиосятпо 0,5 см³ антигена.

Одновременно ставятся контроли па спонтанную агглютинацию анти­гена (0,5 см³ антигена + 0,5 см³карболинизированного физиологического раствора) и флокуляцию сывороток (1 см³ сыворотки в разведении 1:100).

Опытные и контрольные пробирки встряхивают, помещают в термостат При 37-38° С на 16-18 часов, а затем выдерживают их дополнительно при комнатной температуре 5 -6 часов. После указанного срока учитыва­ют результаты реакции общепринятым методом в крестах.

При положительной РА в разведении сыворотки не ниже 1:400 с оценкой не менее чем ++ (два креста) и отрицательных контролях культуру относят к соответствующей серогруппе морганелл. Если агглютинация наблюдается с несколькими сыворотками к разным серогруппам, то культуру относят к той серологической группе, с сывороткой к которой была получена положитель­ная реакция в наибольшем разведении. Если культура агглютинирует с раз­ными сыворотками в одинаковом титре, то учитывают активность этих сы­вороток, и серогрупповую принадлежность определяют по сыворотке, име­ющей минимальную активность (минимальные О — титры, указанные на эти­кетках флаконов).

Если РА оказалась отрицательной со всеми сыворотками набора, то Патогенность выделенных культур устанавливают путем постановки биопробы. Реакция нейтрализации антител предназначена для ускоренной индикации эпизоотических штаммов мор­ганелл в патологическом материале, кормах, объектах внешней среды. Она позволяет обнаружить искомые бактерии в первичных культурах в течение 6-7 часов независимо от присутствия в них посторонних бактерий. Это Исключает необходимость получения чистых культур морганелл с последу­ющей их видовой идентификацией и определением патогенных свойств в биопробе на белых мышах.

Для постановки РНАт необходимо три компонента: исследуемый с це­лью обнаружения морганелл материал; морганеллезные агглютинирующие серогрупповые сыворотки; эритроцитарные морганеллезные диагностикумы (3-4%-ная взвесь формалинизированных эритроцитов барана, на ко­торых адсорбирован О-антиген морганелл определенной серологической группы из числа 8, наиболее часто вызывающих диарею у молодняка жи­вотных).

В первой фазе реакции участвуют исследуемый материал и агглюти­нирующие О-сыворотки. Во вторую фазу к этим компонентам добавляет­ся эритроцитарный диагностикум. Если в исследуемом материале есть морганеллы серогрупп 0l, 016, 026, 029, 033, 045, 049, «13» (О-антигены этих бактерий), то они связываются с антителами агглютинирующей сы­воротки (визуально невидимый эффект). При последующемдобавлении эритроцитарного диагностикума последние не могут участвовать в скле­ивании (агглютинации) эритроцитов, которые образуют на дне лунок по­листироловой пластины осадок в форме диска или кольца (положитель­ный результат РНАт). При отсутствии в исследуемом материале морганелл названных серогрупп антитела сывороток остаются свободными в первой фазе реакции и агглютинируют эритроциты во второй ее фазе, что ведет к образованию на дне лунок осадка в виде «зонтика» (отрицатель­ный результат РНАт).

Точность результатов РНАт зависит от правильно подобранного соот­ношения эритроцитарных диагностикумов и морганеллезных агглютини­рующих сывороток, которое определяют в реакции непрямой гемагглютинации(РНГА).

Для постановки РНГА готовят забуференный физиологический раствор с рН 7,0 -7,2. С этой целью в первую мерную колбу вносят 23,0 г Na₂HP0₄, во вторую — 9,0 г КН₂Р0₄. В обе колбы добавляют дистиллированную воду до отметки 1 литр и тщательно растворяют их содержимое.
К 1 литру свеже­приготовленного физиологического раствора с рН 6,2-6,6 добавляют 10 см³ смеси 1/15 М растворов Na₂HP0₄H КН₂Р0₄в соотношении 7:3 или 8:2 (в зависимости от исходной величины рН физиологического раствора), содержимое колбы тщательно перемешивают. Забуференный физиологи­ческий раствор разливают по 0,4 см³ во все лунки полистироловой плати­ны (кроме первой лунки каждого ряда).

Агглютинирующую сыворотку к определенной серогруппе морганелл разводят забуференным физраствором в отношении 1:100 и вносят по
0,4 см³ в первую (пустую) и вторую лунки двух первых рядов полистироловой пла­стины, а также в две пустые лунки отдельной пластины (контроль сыворот­ки и эритроцитарного диагностикума).

Сыворотку во вторых лунках двух первых рядов перемешивают с забу­ференным физраствором, получая разведение сыворотки 1:400 и т.д. до 12-й лунки, в которой получают разведение сыворотки 1:204800. Из последней 12-й лунки ряда 0,4 см³ жидкости удаляют.

Аналогичным образом, т.е. по два ряда для получения разведений от 1:100 до 1:204800, разливают другие серогрупповые морганеллезные сы­воротки. Двукратное исследование каждого компонента реакции необхо­димо для получения более достоверных результатов реакции.

В приготовленные разведения сывороток вносят по 0,05 см³ (одна кап­ля) морганеллезного эритроцитарного диагностикума, гомологичного се­рогруппе агглютинирующей сыворотки.

Одновременно на отдельной полистироловой пластине ставят следую­щие контроли: 1) контроль сывороток для исключения неспецифической гемагглютинации (0,4 см³ сыворотки в разведении 1:100+0,05 см³ 3,5-
4%-ной взвеси нормальных формалинизированных эритроцитов барана);
2) конт­роль эритроцитарных диагностикумов для исключения спонтанной агглютинации сенсибилизированных эритроцитов (0,4 см³ забуференного физра­створа + 0,05 см³эритроцитарного диагностикума).

Пластины осторожно встряхивают для смешивания компонентов и ос­тавляют на 3 часа при комнатной температуре. После указанного срока учитывают результаты РНГА.

Во всех лунках полистироловой пластины с контролями реакция долж­на быть отрицательной (отсутствие гемагглютинации, осадок эритроцитов в виде диска или кольца). При положительной РНГА эритроциты склеива­ются, образуя на дне лунок осадок в виде «зонтика».

Активность эритроцитарных морганеллезных диагностикумов устанав­ливают по наибольшему разведению гомологичной морганеллезной аг­глютинирующей О-сыворотки, в котором получена положительная РНГА. Данное разведение сыворотки принимают за одну гемагглютинирующую единицу (1 ГЕ).

Морганеллезный эритроцитарный диагностикум, имеющий в РНГА с го­мологичными агглютинирующими сыворотками разных серий титр ниже 1:6400, для постановки РНАт не пригоден.

Подготовка материала для исследования и постановка РНАт. Ис­следуемый материал высевают на плотные селективные питательные сре­ды (агар Плоскирева, висмут-сульфит агар и др.). Посевы инкубируют при 37 -38° С в течение 18 -24 часов, после чего их просматривают, обращая внимание на наличие характерных для морганелл колоний. При необходимости получения чистой культуры для дальнейшей ее родовой и видовой идентификации на скошенный МПА отсевают с агара Плоскире­ва серовато-голубоватого цвета, а с висмут-сульфит агара зеленовато-оливкового цвета мелкие полупрозрачные колонии S-формы. Оставший­ся материал смывают с чашки Петри 6-8 см³ стерильного забуференного физраствора. Полученную бактериальную суспензию прогревают в водя­ной бане при 100° С в течение 15-20 минут и используют для постановки РНАт.

Во все лунки полистироловых пластин наливают по 0,2 см³ забуферен­ного физраствора. В первую лунку каждого ряда вносят 0,2 см³ суспензии, исследуемой на наличие морганелл, и готовят ее последовательные дву­кратные разведения от 1:2 до 1:64 в первых шести лунках каждого ряда. Число рядов лунок с разведениями одного и того же материала должно соответствовать количеству серогрупповых агглютинирующих сывороток и эритроцитарных диагностикумов, используемых в РНАт.

Во все лунки ряда с разведенным исследуемым материалом вносят по 0,2-0,3 см³ морганеллезной агглютинирующей сыворотки определенной серогруппы в разведении 4 ГЕ (например, если в РНГА 1 ГЕ соответство­вала разведению сыворотки 1:25600, то 4 ГЕ будет соответствовать разве­дение этой сыворотки 1:6400). Одновременно для контроля сыворотки то же ее разведение в количестве 0,2 см³ вносят в две лунки с 0,2 см³ забуфе ренного физиологического раствора на отдельной пластине. В результате получают разведение сыворотки, соответствующее 2 ГЕ.

Пластины осторожно встряхивают для перемешивания компонентов реакции и помещают в термостат при 37-38° С на 1 час. Затем их извле­кают из термостата и во все лунки одного ряда добавляют по 0,05 см³ морганеллезного эритроцитарного диагностикума, соответствующего серогруппе агглютинирующей сыворотки в данном ряду. Одновременно на отдельных пластинах ставят два контроля: 1) контроль гемагглюти-нирующей способности сыворотки (серогрупповая морганеллезная аг­глютинирующая сыворотка, использующаяся в основном опыте в разве­дении 2ГЕ и в объеме 0,4 см³ + 0,05 см³ гомологичного эритроцитарного диагностикума); 2) контроль исследуемого материала для исключения неспецифической агглютинации эритроцитов (в лунки с разведениями суспензии бактерий от 1:2 до 1:64 в объеме по 0,4 см³ добавляют по 0,05 см³ 3,5-4%-ной взвеси нормальных формалинизированных эрит­роцитов барана). Пластины вновь встряхивают и оставляют при ком­натной температуре на 3 часа. После указанного срока учитывают ре­зультаты РНАт.

В контроле сывороток должна наблюдаться агглютинация эритроци­тов с образованием в лунках «зонтиков». В контроле исследуемой сус­пензии бактерий во всех разведениях — отсутствие агглютинации (оса­док эритроцитов в виде диска или кольца). При данных результатах кон-тролей реакцию считают положительной в том ряду полистироловой пла­стины, где эритроциты выпадают в осадок в виде диска или кольца (нет их агглютинации) в разведении исследуемого материала от 1:8 и выше. Положительная реакция только в первых двух лунках ряда, а также в контроле исследуемого материала в разведениях 1:2-1:4 не принимает­ся во внимание ввиду возможности неспецифической агглютинации эрит­роцитов.

При отрицательной реакции осадок на дне лунок имеет форму «зонти­ка», что указывает на отсутствие в исследуемом материале морганелл серогрупп, соответствующих использованным эритроцитарным диагностикумам.

Критерием циркулирования на ферме эпизоотических штаммов морга­нелл по результатам РНАт является повторяемость результатов исследова­ния — обнаружение в большинстве проб материала бактерий одних и тех же серогрупп.

Биопроба. Испытуемый штамм морганелл выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором и го­товят суспензию концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1 см³ по опти­ческому стандарту мутности. Приготовленную суспензию вводят внутрибрюшинно по 0,5 см³ трем белым мышам массой 14-16 г. Наблюдение за зараженными животными проводят в течение трех суток. В случае гибели двух и более зараженных мышей испытуемый штамм морганелл признают патогенным.