Зависимости от хозяина и О-серогрупп

Со штаммами, давшими отрицательную реакцию агглютинации, а так­же со штаммами выделенными от птиц, проводят дальнейшие диагности­ческие исследования. При этом определяют их О-групповую принадлеж­ность в РА с поливалентными и моновалентными агглютинирующими О-коли-сыворотками или изучают их патогенность в биопробе на белых мы­шах (штаммы, выделенные от млекопитающих) или цыплятах (штаммы, выделенные от птиц).

Серогрупповая принадлежность эшерихии определяется в реакции аг­глютинации на стекле и в пробирочной реакции агглютинации. Для этого выпускаются наборы агглютинирующих О-коли-сывороток, включающие моновалентные сыворотки к О-антигенам 30 основных серогрупп ЕРЕС, и четыре поливалентные, каждая к О-антигенам 6-8 серогрупп. Агглюти­нирующие О-коли-сыворотки выпускают во флаконах в жидком виде. При­годные к использованию сыворотки представляют собой прозрачную жид­кость светло-желтого цвета.

Ход определения. 1. Испытуемый штамм выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают физиологическим раствором, переносят в стериль­ные пробирки, прогревают в течение часа в водяной бане при температуре 100° С для разрушения поверхностных термолабильных L- и В-антигенов или автоклавируют при температуре 120° С в течение 2-2,5 часов для разрушения термостабильного А-антигена. Если во взвеси бактерий после кипячения или автоклавирования обра­зуются хлопья или зернистость (R-форма), то ее не используют для реакции. Прогретую взвесь бактерий центрифугируют при 3 тыс. об/мин в тече­ние 20 минут, надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в качестве антигена для постановки реакции на стекле. Оставшуюся часть антигена разводят стерильным физиологическим раствором по оптичес­кому стандарту мутности до концентрации 500 млн. микробных клеток в 1см³ и используют для постановки пробирочной реакции агглютинации.

2. На предметное стекло наносят по одной капле каждой из четырех поли­валентных сывороток. В каждую из них бактериологической петлей вносят осажденную центрифугированием культуру и хорошо перемешивают. Реак­ция протекает при комнатной температуре, учитывают ее в течение 3 минут. Положительная реакция характеризуется образованием мелкозернистого аг-глютината и полным или частичным просветлением жидкости. При отрица­тельном результате антиген остается в капле сыворотки в виде равномерной взвеси.

3. Каждый антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных сы­вороток, исследуют в реакции агглютинации на стекле с моновалентными, разведенными 1:10, сыворотками, входящими в состав данной поливален­тной сыворотки, а затем в пробирочной реакции агглютинации с каждой сывороткой, давшей положительную реакцию на стекле.

4. Пробирочную РА ставят в обычных серологических или бактериоло­гических пробирках в объеме 1 мл.

Сыворотку разводят стерильным физиологическим раствором от 1:25 до титра, указанного на этикетке. Для приготовления исходного разведе­ния к 2,4 см³ физиологического раствора добавляют 0,1 см³ сыворотки. Во все другие пробирки разливают по 0,5 см³ физиологического раствора. Из исходного разведения 0,5 см³ смеси переносят во вторую пробирку, из вто­рой — в третью и т.д. Каждое разведение готовят отдельной пипеткой. Со­держимое каждой пробирки смешивают. Из первой пробирки удаляют 1,5 см³, из последней — 0,5 см³ антигена, имеющего концентрацию
500 млн. микробных тел в 1 см³.

Одновременно ставят контроли:

а) антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглюти­нации);

б) сыворотка в разведении 1:25 без антигена (для исключения флокуляции).

Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают 16-18 ча­сов при температуре 37° С и 6-8 часов при комнатной температу­ре.

5. Положительная реакция характеризуется просветлением жидко­сти и образованием на дне пробирки осадка в форме раскрытого зонти­ка, который при встряхивании распадается на мелкие хлопья или ко­мочки.

Реакцию считают отрицательной, когда на дне пробирки образуется оса­док в виде пуговки (диска), который при встряхивании разбивается в рав­номерную взвесь. Аналогичный результат должен быть в контрольных про­бирках.

6. В том случае, когда поливалентные О-коли-сыворотки не агглютини­руют в РА на стекле, антиген, прогретый при температуре 100° С, и суспен­зию из исследуемых бактерий автоклавируют при температуре 120° С в течение 2 -2,5 часов.

Полученный антиген исследуют в пробирочной РА с сыворотками серогрупп 08, 09, 020 и 0101.

7. Исследуемый штамм относят к той О-группе, с сывороткой которой он вступает в реакцию до титра или не ниже половины титра сыворотки.

Определение серогрупповой принадлежности эшерихий имеет важное диагностическое значение, поскольку по морфологическим, ферментатив­ным и культуральным свойствам патогенные и непатогенные разновиднос­ти эшерихий не отличаются друг от друга. В то же время установлено, что из более чем 160 О-серогрупп известных в настоящее время эшерихий лишь около 40 являются основными возбудителями колибактериоза (эшерихиоза) у животных и птиц (табл. 22). Отнесение изучаемого штамма к одной из этих серогрупп дает основание для постановки диагноза на колибактериоз.

е) Определение патогенных свойств E.coli. Патогенность изучаемых штаммов эшерихий может быть установле­на в биопробе на белых мышах или цыплятах. Для этого испытуемый штамм выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором, готовят суспензию концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1см³ по оптическому стан­дарту мутности и вводят внутрибрюшинно по 0,5 см³ трем белым мышам массой 14-16 г или трем цыплятам 3-
4-недельного возраста (при ис­следовании материала от птиц). Наблюдение за зараженными животны­ми проводят в течение трех суток. В случае гибели двух и более зара женных мышей или цыплят выделенный штамм признают патогенным и считают возбудителем инфекции.

Таблица 22 - Основные серогруппы эшерихий, патогенные для животных

Постановка биопробы завершает общепринятую схему бактериологи­ческого исследования материала на колибактериоз (эшерихиоз). При необ­ходимости могут быть проведены исследования токсигенных свойств изу­чаемых штаммов.

Одним из факторов вирулентности эшерихий является продуцируемый ими экзотоксин. Экзотоксины E.coli относят к энтеротоксинам, а штаммы, их продуцирующие, — к энтеротоксигенным E.coli (ETEC). Выявление ЕТЕС позволяет установить диагноз на колибактериоз при бактериологи­ческом исследовании материала. Кроме того, наличие энтеротоксигенных штаммов необходимо учитывать при конструировании вакцин против ко­либактериоза.

ЕТЕС продуцируют два типа энтеротоксинов: термостабильный (ТС) и термолабильный (ТЛ), отличающиеся друг от друга по молеку­лярной массе, структурной организации, иммуногенности и механиз­му действия.

Синтез ТЛ-токсина детерминирован конъюгативной (передающейся другим, в т.ч. и непатогенным, бактериям) плазмидой. Он секретируется во внешнюю среду, окружающую бактерию, адсорбируется на ворсин­ках эпителиальных клеток тонкого кишечника, где стимулирует аденинлатциклазу. Последняя вызывает увеличение концентрации аденозин-монофосфата, который ведет к гиперсекреции воды и хлоридов в про­свет кишечника и угнетению резорбции натрия. Просвет кишки пере­полняется жидкостью, развиваются усиленная перистальтика кишечни­ка и диарея. Молекулярная масса ТЛ-токсина 24000 Д, он является пеп­тидом и обладает антигенными свойствами. Разрушается при 60° С в течение 30 минут, инактивируется в среде с рН 4,0 -5,0 и под воздей­ствием проназы.

ТС-токсин также находится под генетическим контролем гетерогенной группы конъюгативных Ent-плазмид. Адсорбируясь на клетках эпителия тонкого отдела кишечника, он вызывает гиперсекрецию воды и электроли­тов, путем активации гуанилатциклазы. Молекулярная масса ТС-токсина колеблется от 1000 до 10 000 Д, он является гаптеном и не обладает анти­генной активностью. Сохраняет биологическую активность при темпера­туре 65° С в течение 15 мин., при 100° С - 2 мин. Полностью разрушается при кипячении в течение 30 мин. Устойчив к действию трипсина, проназы, протеиназы, дезоксирибонуклеазы. Имеется две разновидности термоста­бильного энтеротоксина: ТСа и ТСв.

Синтез энтеротоксинов у Е. coli не связан с их серогрупповой принад­лежностью. Так, ЕТЕС-возбудители колибактериоза телят могут принад­лежать к серогруппам 08, 09, О20, 026, О101 и другим, колибактериоза поросят — к 08, 045, 0141, 0149, 0149, 0139 и 0157.

Энтеротоксигенные E.coli — возбудители колибактериоза новорожден­ных телят, ягнят и козлят, синтезируют в основном ТСа энтеротоксин (сре­ди них такие штаммы встречаются в 86,4 - 100% случаев), редко — ТЛ-энтеротоксин (0 - 9,1%).

Кроме того, ЕТЕС выделяются при колибактериозе поросят и жеребят, при отечной форме у поросят, редко выделяются от щенков.

Данные о корреляции у штаммов Е. coli между адгезивными антигена­ми, энтеротоксигенностыо и хозяевами представлены в табл. 18.

Под влиянием антибактериального или антиадгезивного иммунитета или специфических сывороток ЕТЕС теряют способность к адгезии и не проявляют энтеротоксичности. То же происходит с энтеротоксигенными Е. coli при утрате ими плазмид, детерминирующих адгезивные антигены.

Таблица 23 - Взаимозависимость между адгезинами,