Завдання 1. Кількісне визначення активності амілази слини за методом Вольгемута

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості 0,1%-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37^оС протягом 30 хв. В нормі амілазна активність слини – А = 160 – 320 одиниць.

Хід роботи. У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл води. У першу пробірку додають 1 мл розведеної в 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – в третю, таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менше, ніж у попередній. Потім в усі пробірки додають по 2 мл 0,1%-го розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 37°С на 30 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1%-ний розчин йоду в 0,2%-ному розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності слини:

Розрахунок. Для розрахунку активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/160 мл слини розщеплює 2 мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1мл слини розщеплює - Х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки X= ^{1 ×2} = ^2×160 = 320 мл

^{1/160 1}

А отже: А (амілазна активність) = 320 одиниць.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі.