Разработка ингбиторов переходного состояния sEH

Ранние неконкурентные ингибиторы sEH были слишком нестабильны для эффективного использования in vivo (Mullin and Hammock, 1982). Первый мощный конкурентный ингибитор sEH включал такие вещества как промышленный побочный продукт дициклогексил мочевину (DCU) и различные дифенилмочевины (Morisseau et al., 1999). Хотя и будучи довольно мощными, эти и подобные соединения такие как 1-циклогексил-3-додецил мочевина (CDU) было сложно использовать in vivo и как и все липофильные высокоплавкие твердые вещества, тяжело обрабатывать в лекарственные формы. Однако, доступность ингибиторов позволила посредством рентгеноструктурного анализа показать образование водородной связи между мочевинным ингибиторов и активным центром фермента (Argiriadi et al., 2000), подтверждая предыдущие кинетические свидетельства конкурентного ингибирования с использованием высокоафинного субстрата транс-дифенилпропен оксида (t-DPPO) (Morisseau et al., 1999). В последующем исследовании, Morisseau et al. (2010) определили Vm, Km и Kcat различных эпоксижирных кислот и обнаружили что как и t-DPPO они имеют высокую специфичность (Vm/Km). Эта работа показала что занятие ингибитором большого объема в полости фермента критически важно для эффективного ингибирования фермента in vivo. Прорыв был сделан когда была синтезирована 1-(адамантан-1-ил-урейдо)-додекановая кислота (AUDA) как аналог 14,15-эпоксида арахидоновой кислоты. Внутри этой молекулы додекановая кислота копировала альфа конец арахидоновой кислоты, а 1,3-мочевина использовалась как копия эпоксида и его переходного состояния и адамантана был использован для копирования омега гидрофобного хвоста (Morisseau et al., 2002). Адамантан был удачным выбором, так как легко детектировался LC-MS так что только несколько микролитров крови было необходимо для изучения содержания in vivo и позволил оптимизировать будущие структуры для PK-ADME (Watanabe et al., 2006). AUDA остается одним из наиболее мощных ингибиторов sEH со значительно большей активностью чем кандидат фирмы IND AR9281 который описан ниже. Однако его физические свойства и быстрый метаболизм сделали его сложным для применения. Более того его активность как среднего PPAR альфа агониста (Fang et al., 2005) и как аналог эпоксижирных кислот (Olearczyk et al., 2006) сделали его непредпочтительным.

Последующая работа в этой и других сериях соединений привела к соединения с улучшенными физическими свойствами, лучшей ингибирующей активности и PK-ADME (Morisseau and Hammock, 2013). В общем, большинство из этих соединений содержат мочевинный фармакофор, однако, некоторые содержат карбаматные или амидный группы, которые формируют сильное взаимодействие переходного состояния в активным центром фермента. Похожесть активного центра sEH и активных центров други альфа/бета сложенных ферментов делает возможным что ингибиторы таких ферментов, в том числе ингибиторы гидролазы амидов жирных кислот (FAAH) могут ингибировать sEH. Хотя физические свойства немного улучшились, многие ингибиторы имеют высокие температуры плавления и низкую водорастворимость. В целом, повышение водорастворимост и снижение температуры плавления являются важными целями. Довольно легко работать с водорастворимыми веществами несмотря на высокую температуру плвления и даже при повышенной липофильности создание лекарственных форм остается относительно несложной пока температура плавления не высока даже при высокой активности. Для высокоплавких, липофильных соединений эффективность биологических испытаний зависит от тщательной подготовки лекарственных форм. К счастью когда повышается ингибирующая активность и PK-ADME, то необходимая доза уменьшается и создание лекарственных форм упрощается (Shen and Hammock, 2012). Развитие высокопроизводительных техник исследования ингибирующей активности было необходимо для экспериментов структура-свойство в целях оптимизации ингибирующей активности, растворимости и температуры плавления. Доступность рекомбинантного фермента а высокоэффективного флуорсецентного субстрата CNMPO синтезированного Jones et al. (2005) позволило разработать быстрые методы определения ингибирующей активности. Позднее ингибиторы также стали исследовать с помощью флуоресцентного маяка (ACPU), который вступает в форстерский резонанс с триптофаном находящимся вблизи активного центра sEH.

Этот метод снизил нижнюю границу отпределения активности и может быть использован для вычисления koff – скорости с которой ингибитор покидает активный центр (Lee et al., 2013; Lee et al., 2014). Хорошее удержание на ферменте определяемое параметром koff является важным для предсказания эффективности ингибиторов sEH in vivo. Это происходит потому что ингибитор конкурирует хотя и с незначительным количеством, однако обладающими огромной биологической активностью субстратами имеющими очень высокое сродство к ферменту (Morisseau et al., 1999; Schebb et al., 2011). Вместе с ростом активности фармакокинетика изменилась с сильно алифатических быстро метаболизируемых ингибиторов на соединения с высоким временем полураспада в различных видах включая собак и нечеловекообразных приматов (Tsai et al., 2010; Ulu et al., 2012). Ингибиторы также эволюционировали до многоцелевых включая циклооксигеназу (COX) (Hwang et al., 2011) и липооксигеназу (Meirer et al., 2013). Двойное ингибирование sEH/COX приводит к синергизму, который значительно повышает активность таких соединений (Zhang et al., 2014). В процессе оптимизации медицинской химии, многие из таких соединений были исследованы как кандидаты для клинических испытаний.