Лабораторна робота 3

(4 години)

«Методи дослідження лімфоцитів»

Мета роботи: навчитися отримувати лімфоцити з дефібринованої крові; навчитися підраховувати кількість різних субпопуляцій лімфоцитів; навчитися готувати препарати крові для визначення співвідношення Т- та В- лімфоцитів.

План:

1. Загальна характеристика лімфоцитів та їх субпопуляцій.

2. Маркери Т-лімфоцитів, визначення Т-клітин та їх субпопуляцій.

3. Т-клітинний рецептор і пов’язані з ним структури.

4. Генез Т-лімфоцитів.

5. Формування субпопуляцій Т-клітин.

6. Рецептор В-клітин для розпізнавання антигену. Його будова.

7. Генез В-лімфоцитів.

8. Субпопуляції В-лімфоцитів, їх маркери, функції.

Матеріали та обладнання: світловий мікроскоп, імерсійне масло, знежирені предметні скельця, дефібринована кров людини або лабораторних тварин, порошок фіколу, 60% або 76% розчин верографіну, розчин фікол-урографіну з питомою густиною р = 1,077 г/мл; бараняча кров (еритроцити барана), розчин Хенкса, середовище 199, гемолітична сироватка, мишача сироватка, Т- та В-системи, фарба Романовского-Гімзе, 0,9%-ий розчин NaCl, етиловий спирт; стерильні пластикові або скляні пробірки об’ємом 1 – 2 мм³; центрифуга, центрифужні пробірки, зрівноважувачі для пробірок, пастерки, гумові груші №1, (або готові препарати для підрахунку Т- та В-лімфоцитів).

Завдання на виконання:

1. Самостійно виділити лімфоцити з периферійної крові в градієнті густин фікол-верографіну (центрифугування, 1500 об/хв, 15 – 20 хв):

1.1. В чисту пробірку №1 наливають 1 мл гепаринізованої крові і додають 3 мл фізіологічного розчину.

1.2. В пробірку №2 наливають 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл). Обережно, по внутрішній стороні пробірки пастеркою з грушею додають 2,5 – 3 мл розведеної крові з пробірки №1.

1.3. Кров центрифугують упродовж 20 хв за кімнатної температури при 1500 об/хв.

1.4. Після центрифугування в пробірці спостерігають чотири фракції (Рис.3.1): І – уламки клітин і еритроцити; ІІ – градієнт густини фікол-верографіну; ІІІ – лімфоцити; ІV – плазма крові.

2. Обережно підвести кінчик пастерки до шару лімфоїдних клітин і за допомогою гумової груші відібрати ці клітини і перенести їх в стерильну пробірку.

3. Клітини відмити в середовищі 199 за допомогою центрифугування (центрифугування 1500 об/хв, 5 – 7 хв).

4. Після центрифугування надосадову рідину злити, до осаду додати 0,5 – 1 мл середовища 199, осад ресуспендувати.

5. Одержану суміш лімфоцитів розділити на кілька проб у різні пробірки, додати Т-систему (проба №3) та В-систему (проба №4).

6. Проби №3 з Т-лімфоцитами (Т-системою) струшують та ставлять на 30 хв у термостат за 37°С, потім на 1 год у холодильник за температури 6 – 8°С. Виймають з холодильника, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

7. Проби №4 з В-лімфоцитами (В-системою) струшують та ставлять на 15 хв у термостат за 37°С. Виймають з термостата, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

8. Провести фарбування мазків крові (Лаб. роб. №2):

Спосіб №1. На мазок крові наносять фарбу-фіксатор Мая-Грюнвальда на 3 хв; фарбу змивають дистильованою водою; потім на мазок наносять розведену фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2) на 20 хв; мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

Спосіб №2. На мазок крові наносять етиловий спирт на 20 – 25 хв до випаровування фіксатора; зафіксовані мазки забарвлюють упродовж 20 хв фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2); мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

9. Підрахувати формені елементи крові у мазках за допомогою світлового мікроскопу (´90) з імерсією: визначити відсоток лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів (закінчення Лаб. роботи №2).

10. Порівняти одержані значення кількості клітин зі значення нормальних показників крові здорової людини або тварин.

10.1. Показники складу крові щурів:

Таблиця 3.1.

Date: 2015-07-02; view: 299; Нарушение авторских прав