Визначення каротину в сироватці крові

Каротин є попередником вітаміну А. Перетворення його у вітамін А відбувається в стінці тонкого кишечнику.

Принцип методу. Каротиноїди осаджуються спиртом, а потім екстрагуються з осаду петролейним ефіром або авіаційним бензином.

Реактиви: етанол (96 %), петролейний ефір чи авіаційний бензин, калій двохромовокислий (K₂Cr₂O₇).

Обладнання: КФК-2, КФК-3, ФЕК-56М, центрифуга, центрифужні пробірки, піпетки на 2 і 10 мл, автоматична піпетка (1000 мкл).

Методика визначення. В центрифужні пробірки вносять по 1 мл сироватки крові, 3 мл етилового спирту. Вміст пробірок перемішують тонкою скляною паличкою до утворення однорідної суміші, до якої додають 6 мл петролейного ефіру чи авіаційного бензину. Пробірки із сумішшю закривають корками, інтенсивно струшують протягом 1–2 хв, додають по 0,5 мл дистильованої води (по стінці пробірок) і ставлять у штатив на 10 хв для розділення органічної та неорганічної фаз. Верхній шар рідини, що містить каротиноїди (4–4,5 мл), відбирають у чисті пробірки і визначають оптичну щільність (ОЩ) дослідних зразків і робочого стандартного розчину калію двохромовокислого проти контрольного розчину (петролейний ефір) при довжині хвилі 440 нм (синій світлофільтр).

Основний стандартний розчин калію двохромовокислого: 36 мг K₂Cr₂O₇ розчиняють у 50 мл дистильованої води.

Робочий стандартний розчин калію двохромовокислого: змішують 5 мл основного стандартного розчину K₂Cr₂O₇ і 5 мл дистильованої води.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = (А: Б) ´ 1248,

де Х – концентрація каротину в сироватці крові (мг/100 мл);

А – оптична щільність дослідного зразка;

Б – оптична щільність робочого стандартного розчину калію

двохромовокислого;

1248 – коефіцієнт для перерахунку каротину в мг/100 мл.

Кількість каротину у сироватці крові великої рогатої худоби залежить від віку. У сироватці крові телят до двомісячного віку, свиней і дрібної рогатої худоби каротин не визначається.

Зменшення вмісту каротину у крові – гіпокаротинемія спостерігається при недостатньому надходженні провітаміну з кормом.

3.12. Визначення вітаміну А та каротину
в сироватці крові (за методом Бессея в модифікації
В.І.Левченка зі співавт., 1998)

Суть методу полягає у лужному гідролізі та екстракції вітаміну А і каротину з сироватки крові (молозива) за допомогою малолетких розчинників з наступним спектрофотометричним вимірюванням ступеня поглинання світла розчином до і після руйнування вітаміну А під дією ультрафіолетових променів.

Обладнання: СФ-16, СФ-46 або фотоелектроколориметри КФК-2, КФК-3, ртутно-кварцева лампа ДРТ-400, вентилятор настільний, водяна баня, пробірки центрифужні циліндричні та пробірки об’ємом 10 мл з притертими пробками із скла “пірекс” або з кварцового скла, які пропускають ультрафіолетове проміння, піпетки.

Реактиви: а) 11 N-ний розчин КОН у 96°-ному етанолі (для приготування 100 мл розчину КОН необхідно до 5,6 г КОН додати 6,0 мл дистильованої води, розчинити його і довести об’єм до 100 мл етанолом, після чого суміш старанно перемішати); б) ксилол-октанова суміш (аа), яку готують за кілька годин до роботи.

Хід визначення. У центрифужні пробірки вносять по 2 мл сироватки крові (молозива) і спиртового розчину КОН, перемішують тонкою скляною паличкою до утворення однорідної суміші. Пробірки ставлять для гідролізу у водяну баню на 20 хв при 60 °С (через кожні 10 хв перемішують). Після гідролізу пробірки охолоджують протягом 10 хв у морозильній камері холодильника. У кожну пробірку додають по 4 мл ксилол-октанової суміші, пробірки закривають корками, інтенсивно струшують протягом 2–3 хв, знову охолоджують 5–7 хв, а потім центрифугують 10–15 хв при 1500–3000 об/хв. Верхній шар, що містить екстракт вітаміну А і каротиноїдів у ксилол-октановій суміші, відбирають піпетками у пробірки із скла “пірекс”. Фотометрію проводять у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм, а для контролю використовують ксилол-октанову суміш. Визначення каротину на СФ-46 проводять при довжині хвилі 460 нм, ретинолу – 328 нм (на КФК-2 або КФК-3 відповідно 440 і 315 нм). Оптичну густину суміші для визначення вітаміну А вимірюють до і після опромінення пробірок ультрафіолетовими променями протягом 50 хв, для чого пробірки із скла “пірекс” щільно закривають притертими скляними пробками і ставлять на віддалі 15–20 см від лампи ДРТ-400 або ПРК-5. Для охолодження пробірок під час опромінення використовують два настільні вентилятори. За різницею оптичної густини, отриманої при фотометрії до і після опромінення, визначають концентрацію вітаміну А у сироватці крові (молозиві).

Розрахунок проводиться за формулами:

Вітамін А, мкг/100 мл = (Е₁ – Е₂)·1274 (на СФ-16, СФ-46)

або (Е₁ – Е₂) · 1500 (на КФК-2, КФК-3),

де: Е₁ – екстинція розчину до опромінення при довжині хвилі 315 нм; Е₂ – екстинція розчину після опромінення при довжині хвилі 315 нм; 1274 та 1500 – коефіцієнти для визначення вітаміну А.

Каротин, мкг/100 мл = Е · 762 (на СФ-16; СФ-46)
або Е·850 при роботі на КФК-2; КФК-3,

де: Е – екстинція розчину при довжині хвилі 440 нм; 762 та 850 – коефіцієнти для визначення каротину.

Кількість каротину у сироватці крові залежить від віку і виду тварин. У новонароджених телят містяться сліди каротину, у одномісячних – 20–50 мкг/100 мл, у молодняку 3–6-місячного віку – 250–800, у тварин більш старшого віку і корів – 450–1250 мкг/100 мл. У пасовищний період вміст каротину може сягати 2 мг/100 мл сироватки. Незважаючи на те, що каротин засвоюється телятами з перших днів життя, оцінювати стан А-вітамінного обміну у телят за цим показником неможливо до 2–3-місячного віку, оскільки кількість його незначна і непоказова. У сироватці крові свиней та овець каротин відсутній.

Кількість каротину в сироватці крові свідчить про надходження його з кормами, але він не є критерієм забезпеченості тварин вітаміном А. Навіть при низькому вмісті каротину в сироватці крові А-гіповітаміноз може не розвиватися внаслідок того, що до складу преміксу входить ретинол. За певних умов (нестача йоду) А-гіповітаміноз, навпаки, розвивається при нормальній і навіть підвищеній кількості каротину в сироватці крові.

Одним із найбільш точних показників забезпеченості організму ретинолом є його рівень у сироватці крові. За його вмістом можна діагностувати А-гіповітаміноз. У сироватці крові клінічно здорових телят 5–10-денного віку вміст вітаміну А має становити 9–15 мкг/100 мл, у телят місячного віку – 12,5–25; тримісячного – 15–35; у молодняку старше тримісячного віку – 30–80 мкг/100 мл. Вміст вітаміну А у корів у стійловий період становить 25–80 мкг/100 мл; у пасовищний – 40–150; у свиней – 20–50; у овець і коней – 15–25 мкг/100 мл.

Date: 2015-07-01; view: 398; Нарушение авторских прав