Постановка прямой и непрямой РИФ.

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Знать алгоритм постановки прямой и непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ).
2. Знать алгоритм постановки твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
3. Уметь оценить показатели иммунограммы и знать, как расшифровать следующие сокращения: CD, ИРИ, ФЧ, ФИ, CH50, ЦИК, НСТ, Ig, РБТЛ, ФГА, ЛПС и КонА.

Алгоритм постановки прямой РИФ

На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-отпечатки.

Препараты подсушивают, фиксируют, наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20 - 30 мин (или на 25 - 40 мин при 18 - 21 °С).

Затем для удале­ния избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуферном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10 – 15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в течение 10 мин.

Сушат при комнатной температу­ре и просматривают с использованием люминесцентного микроскопа и масляной иммерсионной системы.

Интенсивность специфической реакции флюоресценции бактериальных клеток оценивают по четырехплюсовой шкале:

"++++" - очень яркая; "+++" - яркая; "++" - выражен­ная ободочная флюоресценция; "+" - слабое свечение клеток.

Обязательны три контроля обработки флюоресцирующими антитела суспензии:

1) гомологичных бактерий (положительный контроль 2) гетерологичной культуры (отрицательный); 3) незараженного материала (отрицательный).

Алгоритм постановки непрямой РИФ

На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-отпечатки.

Препараты подсушивают, фиксируют, наносят на них обычную специфическую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20 - 30 мин (или на 25 - 40 мин при 18 - 21 °С).

Затем для удале­ния избытка антител препарат промывают в забуферном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10 – 15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в течение 10 мин.

Препараты подсушивают, наносят на них флюоресцирующую антииммуноглобулиновую (специфически взаимодействующую с иммуноглобулинами человека) сывортку, взятую в рабочем разведении, и снова помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20 - 30 мин (или на 25 - 40 мин при 18 - 21 °С).

Сушат при комнатной температу­ре и просматривают с использованием люминесцентного микроскопа и масляной иммерсионной системы.

Интенсивность специфической реакции флюоресценции бактериальных клеток оценивают по четырехплюсовой шкале:

"++++" - очень яркая; "+++" - яркая; "++" - выражен­ная ободочная флюоресценция; "+" - слабое свечение клеток.

Обязательны три контроля обработки флюоресцирующими антитела суспензии: 1) гомологичных бактерий (положительный контроль 2) гетерологичной культуры (отрицательный); 3) незараженного материала (отрицательный).

Алгоритм постановки твердофазного иммуноферментного анализа.

В настоящее время чаще применяется твердофазная модификация ИФА, при этом антитела или антигены сорбируются в лунка: полистироловых планшет (на твердой фазе).

В большинстве случаев к твердой фазе присоединяются анти­гены, которые при инкубации с сыворотками пациентов улавливают специфические антитела.

К образовавшемуся при этом иммунокомплексу прибавляются затем меченные пероксидазой антииммуноглобулиновые антитела, специфические к антителам человека – антииммуноглобулиновая сыворотка.

В результате образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому ортофенилендиамина (хромогена) и Н₂0₂ в качестве субстрата для пероксидазы происходит пожелтение в лунке (изменение цвета хромогена вследствие образования супероксиданиона кислорода в результате расщеплении пероксида пероксидазой).

Результаты твердофазной модифика­ции ИФА учитывают с использованием специального спектрофотометра.