Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диаметра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вариантах.

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

– увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);

– уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);

– уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);

– уменьшить расход (объем) ПФ;

– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.

Применение ВЭТСХ обеспечивает получение более компактных пятен разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики количественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.

1.3. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0095-09)

Газовая хроматография – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит газ, движущийся через колонку, заполненную неподвижной фазой.

Применяют как газоадсорбционную, так и газожидкостную (преимущественно) хроматографию.

Анализ проводят на специальных приборах – газовых хроматографах.

Основные узлы газового хроматографа: источник подвижной фазы, устройство ввода пробы, колонка с термостатом, детектор, система сбора и обработки данных. Требуемые температурные режимы устройства ввода пробы, колонки и детектора устанавливаются в соответствующих термостатах.

Подвижная фаза

В качестве подвижной фазы используются азот, гелий или водород. Эти газы-носители могут подаваться в систему либо из баллонов, либо из газогенераторов, позволяющих получать газ высокой чистоты. Газ проходит через блок регулировки и стабилизации потока газа, обеспечивающий возможность измерения его скорости и давления на входе в хроматограф.

Ввод пробы

Наиболее распространен способ ввода жидкой пробы (раствора) в испаритель шприцем через самоуплотняющуюся мембрану. Однако хроматограф может быть укомплектован дозатором (в том числе, автоматическим) для ввода газообразных, жидких или твердых веществ.

Инжектирование методом выдувания и накопления(purge and trap) используется для извлечения легколетучих компонентов и накопления их в специальной адсорбционной ловушке (колонке) с последующей быстрой тепловой десорбцией и вводом в хроматографическую колонку.

Устройство парофазного концентрирования (head-space) позволяет повысить чувствительность определения летучих соединений.

Колонки

Используются три типа аналитических колонок: насадочные (набивные), микронасадочные и капиллярные.

Насадочные колонки (НК) изготавливаются из металла (нержавеющая сталь, никель, медь), стекла, тефлона и других материалов. Для разделения неустойчивых соединений (каталитически разлагающихся при контакте с металлической поверхностью) используют стеклянные или тефлоновые колонки. По форме НК бывают прямые, U-образные, W-образные и спиральные. Внутренний диаметр НК составляет от 2 до 4 мм, а длина – от 1 до 4–5 м. Внутренний диаметр микронасадочных колонок 0,5–1 мм и длина от 0,5 до
3 м.

Капиллярные колонки изготавливаются из кварца и имеют форму спирали. По своим характеристикам (внутреннему диаметру, d) они делятся на капиллярные (d = 0,2–0,3 мм, длина от 5 до 100 м), узкие капиллярные
(d = 0,05–0,2 мм, длина от 5 до 100 м), капиллярные широкого диаметра
(d = 0,3–0,8 мм, длина от 10 до 60 м) и поликапиллярные (d = 0,04 мм, длина 0,2 или 1 м).

В насадочных и микронасадочных колонках набивка сорбента внутри трубки должна быть плотной и однородной, без пустот. Чем плотнее и однороднее набивка, тем меньше размывание пиков и больше эффективность колонки.

В капиллярных колонках слой сорбента наносится на внутреннюю поверхность капилляра в виде слоя жидкой неподвижной фазы или в виде слоя адсорбента толщиной от 0,1 до 5,0 мкм, роль которого чаще всего выполняет полимерная пленка. В зависимости от характеристик капиллярных колонок и концентрации анализируемых соединений в образце введение пробы в колонку осуществляется с делением потока или без деления потока.

Системы программирования температуры колонки позволяют улучшить разрешение и сократить время анализа.

Детекторы

Наиболее важные характеристики детекторов – чувствительность, линейный динамический диапазон (диапазон концентраций определяемого вещества, в котором наблюдается линейная зависимость сигнала детектора от концентрации) и селективность.

Чаще всего применяют пламенно-ионизационный детектор (ПИД). Это обусловлено его высокой чувствительностью к большинству органических соединений и чрезвычайно широким линейным динамическим диапазоном (6–7 порядков), что крайне важно при проведении количественных анализов. Применяют также детекторы других типов – детектор по теплопроводности (катарометр), термоионный (ТИД), электронно-захватный (ЭЗД), масс-спектрометрический. В зависимости от конкретной задачи могут быть использованы и детекторы других типов – пламенно-фотометрический, фотоионизационный, Фурье-инфракрасный и др.

чувствительность ТИД по отношению к азот- и фосфорсодержащим соединениям выше чувствительности ПИД примерно на 2 и 3 порядка, соответственно.

ЭЗД – высокоселективный детектор, чувствительный к соединениям, содержащим галогены, серу, фосфор, нитраты, кислород.

Неподвижные фазы

В газоадсорбционной хроматографии в качестве сорбентов (адсорбентов) используют неорганические (силикагель – Сферосил, Порасил, Силихром и др.; графитированная термическая сажа – Карбопак С и В, Карбосив, Карбосфер; молекулярные сита – алюмосиликаты натрия и кальция) и пористые полимерные сорбенты.

В газожидкостной хроматографии неподвижная фаза (сорбент) представляет собой жидкость, нанесенную на твердый носитель. Носитель – относительно инертный адсорбент с низкой удельной поверхностью, на которой должна удерживаться неподвижная фаза в виде пленки равномерной толщины. Носитель должен быть механически прочным, иметь по возможности сферическую форму и макропористую структуру. Применяют минеральные и полимерные носители. Большинство минеральных носителей представляют собой переработанные диатомиты. Обычно используются носители с размерами частиц в интервалах от 125 до 150 мкм или от 150 до 180 мкм.

Неподвижные фазы – это обычно высококипящие жидкости. Они различаются по температурному пределу использования (низкотемпературные – до 100 °С; среднетемпературные – до 200 °С; высокотемпературные – до
350 °С) и по полярности. Все неподвижные фазы делят на 4 группы – неполярные, слабополярные, среднеполярные и сильнополярные.

По химическому составу неподвижные фазы в своем большинстве принадлежат к следующим классам: алифатические и ароматические углеводороды; фталаты и фосфаты; простые и сложные эфиры, полиэфиры; полигликоли; силоксаны с неполярными, среднеполярными и полярными радикалами; нитрилы и нитрилэфиры. Разработаны также привитые неподвижные фазы, которые представляют собой нанесенную химическим путем почти монослойную пленку. Такие сорбенты называются бондапаками. Они характеризуются высокой термостойкостью, большей инертностью и обеспечивают более высокую эффективность колонок по сравнению с другими сорбентами.

Методика

В описании методики должны быть указаны: тип детектора, тип колонки (насадочная или капиллярная), материал и размеры колонки, сорбент (тип твердого носителя и его характеристики, неподвижная жидкая фаза и ее количество), метод введения пробы и его параметры, температура испарителя, колонки и детектора, газ-носитель и его расход.

1.4. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда называют «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и обращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором используются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с привитыми NH₂- или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с различными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии используют неполярные химически модифицированные сорбенты (например, неполярный алкильный радикал C₁₈) и полярные подвижные фазы (например, метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых негазообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняющимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Смешение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании, однако более точное соотношение компонентов достигается при предварительном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превышало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Смесители

По своей конструкции смесители могут быть статическими или динамическими.

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из отдельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешивание растворителей обычно происходит самопроизвольно, но иногда применяются системы с принудительным смешиванием.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными для ввода проб от
1 мкл до 2 мл или дискретными для ввода пробы только определенного объема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен непосредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока ПФ и осуществлять предварительное введение пробы в петлю определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл). Этот объем указан на маркировке петли. Конструкция инжектора позволяет осуществлять замену петли. Для введения анализируемого раствора в неавтоматический инжектор используется ручной микрошприц с объемом, значительно превосходящим объем петли. Избыток введенного раствора, не поместившийся в петле, сбрасывается, и в колонку вводится точный и всегда одинаковый объем пробы. Ручное неполное заполнение петли снижает точность и воспроизводимость дозирования и, следовательно, ухудшает точность и воспроизводимость хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закрытые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитической колонки в зависимости от механизма хроматографического разделения может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более (обычно она составляет
10–25 см), внутренний диаметр – от 2 до 10 мм (обычно 4,6 мм). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хроматографии. Используются также капиллярные колонки с внутренним диаметром около 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии имеют внутренний диаметр до 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие колонки (предколонки) выполняющие различные вспомогательные функции (чаще – защита аналитической колонки). Обычно анализ проводят при комнатной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и сокращения продолжительности анализа может быть использовано термостатирование колонок при температурах не выше 60 °С. При более высоких температурах возможна деструкция сорбента и изменение состава ПФ.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нормально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном случае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фазами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвижной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень химической модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость.

В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октильные группы [Si-(CH₂)₇-CH₃] (сорбент октилсилан или С₈);

– октадецильные группы [Si-(CH₂)₁₇-CH₃] (сорбент октадецилсилан (ODS) или С₁₈);

– фенильные группы [Si-(CH₂)_n-(C₆H₅)] (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы [Si-(CH₂)₃-CN] (сорбент CN);

– аминопропильные группы [Si-(CH₂)₃-NH₂] (сорбент NH₂);

– диольные группы [Si-(CH₂)₃-OCH(OH)-CH₂-OH] (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С₁₈.

В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH₂», «диол») в сочетании с неполярными растворителями.

Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более. Используются также монолитные сорбенты.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопических размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колонки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция, показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физического или физико-химического параметра ПФ от времени.

Наиболее распространенными являются спектрофотометрические детекторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптической плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрасной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом случае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.

Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.

С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгновенно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых компонентов.

Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Современные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хроматограммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анализируемых соединений.

Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).

используются также электрохимические детекторы (кондуктометрические, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые другие.

Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные органические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для оптимизации разделения часто используют водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неорганических и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (например, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахиральном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившихся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.