Умови культивування дріжджів

Дріжджі вирощували за умов аерації при 28 ^оС протягом 24 год у середовищі YPD, яке містило 2% пептону, 1% дріжджового екстракту та 2% глюкозу. Отримані культури з розрахунку 1×10⁶ кл/мл переносили у середовище культивування такого ж складу. Культивування здійснювали на шейкері (175 коливань/хвалину) при 28 ^оС протягом ночі. Після досягнення стаціонарної фази росту, експериментальну культуру використовували для отримання клітинних екстрактів з подальшим визначенням біохімічних параметрів.

2.3. Умови отримання безклітинних екстрактів.

Після стресу клітини осаджували центрифугуванням при 2500 g протягом 5 хв і відмивали в середовищі, яке містило 50 мМ КФБ (рН 7,0). Після останнього відмивання клітин, до осаду додавали суміш буферу (50 мМ КФБ (рН 7.0), 0,5 Мм ЕДТА і 1 мМ фенілметилсульфонілфторид). Об’єм буферу становив 1200 мкл. Клітини дезінтегрували на вортекс-міксері зі скляними кульками діаметром 450-500 мкм. Руйнували клітини протягом 10 циклів, кожен з яких складався з 1 хв вібрації з кульками і 1 хв охолодження в льоді. Скляні кульки і незруйновані рештки клітин осаджували при 13000 g протягом 15 хвилин (4 ^оС). Отримані супернатанти використовували для визначення біохімічних параметрів.

2.4. Оцінка загальної антиоксидантної здатності.

Загальну антиоксидантну здатність визначали спектрофотометрично (Labsystems Multiskan Mcc/340)за швидкістю знешкодження антиоксидантами безклітинних екстрактів дріжджів катіон-радикалу ABTS^•+, максимум оптичного поглинання якого знаходиться при довжині хвилі 414 нм (Erel O 2004). ABTS ^•+ радикал генерується внаслідок взаємодії 2,2’-азино-біс (3-етиленбензтіазолін-6-сульфонату) (ABTS) з H₂O₂ в ацетатному буфері (рН 3,6) при витримуванні протягом 1 год в темряві за кімнатної температури (до появи характерного темно-зеленого кольору ABTS ^•+). У присутності антиоксидантів забарвлений ABTS ^•+ відновлюється до вихідної безбарвної формиABTS. Швидкість реакції калібрується за Tролоксом (Trolox, 6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновою кислотою), який є водорозчинним аналогом вітаміну Е. Результати представлені в тролоксових одиницях (мілімоль) на мг білка.