Лабораторная работа. 1. Определение активности a-амилазы в крови Оборудование: 1. Штатив с пробирками. 2. Мерная коническая пробирка

1. Определение активности a-амилазы в крови

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении уменьшения концентрации крахмала в пробах после ферментативного гидролиза по сравнению с исходным уровнем, что служит мерой активности амилазы.

Ход работы. В 2 пробирки (опытная и контрольная пробы) наливают по 0,5 мл крахмального субстрата. Опытную пробу прогревают при 37^ОС 5 мин, после чего добавляют в нее 0,01мл сыворотки и инкубируют 8 мин при 37^ОС в термостате. Сразу же после инкубации опытной пробы в обе пробирки добавляют по 0,5 мл раствора йода и доводят объем проб до 5 мл дистиллированной водой. Сразу же колориметрируют их при красном светофильтре в кюветах толщиной 1 см против воды.

Активность a-амилазы рассчитывают по формуле:

(Е_К – Е_ОП)/Е_К х 150 = г крахмала, гидролизованного 1л сыворотки за 1 час инкубации (г/л), где

Е_К – оптическая плотность контрольной пробы,

Е_ОП – оптическая плотность опытной пробы,

150 – коэффициент пересчета на количество крахмала в г, гидролизованного 1 л сыворотки за 1 час инкубации.

Норма активности амилазы в сыворотке – 16-30 г/л в час

2. Определение активности a- амилазы в моче

Работу проводят так же, как с сывороткой крови, только в опытную пробу вместо сыворотки добавляют 0,01 мл мочи, разведенной в 100 раз. При расчете активности фермента в формулу добавляют коэффициент, учитывающий разведение мочи.

Норма активности амилазы в моче – 28-160 г/л в час

3. Определение активности a-амилазы в слюне

Работа проводится так же, как с сывороткой и мочой. В опытную пробу добавляют 0,01 мл разведенной в 10 раз слюны. При расчете учитывают коэффициент разведения.

Норма активности амилазы в слюне – 320-640 г/л в час.

Диагностическое значение определения амилазы

Гиперамилаземия. При остром панкреатите активность амилазы крови возрастает в первые 12 – 24 часа в 10-40 раз, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6 сутки.

При остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки активность амилазы повышается в 3-5 раз.

Гиперамилаземия наблюдается также при паротите.

Гиперамилаземию вызывают: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, антикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, алкоголь.

Гипоамилаземия. Чаще всего снижение активности амилазы свидетельствует о недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Также встречается у больных гепатитами, циррозами, злокачественными опухолями с метастазами в печень, обширными ожогами кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, при интоксикациях.

Гиперамилазурия. При остром панкреатите в суточной моче активность амилазы возрастает в 10-40 раз. При этом активность амилазы остается высокой до 7 суток.

Отношение активности амилазы в крови к активности амилазы в моче служит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.

Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)

А) Вопросы для защиты лабораторной работы

1. К какому классу ферментов относится амилаза?

2. Назовите субстраты для амилазы.

3. Где образуется амилаза и где действует?

4. Назовите продукты амилазной реакции.

5. Какой принцип лежит в основе метода определения активности амилазы?

6. С какой целью пробы помещают в термостат?

7. Для диагностики каких заболеваний используется определение активности амилазы в крови? моче? слюне?

8. Каковы причины снижения активности амилазы в крови?

9. Каковы причины увеличения активности амилазы в крови?

10. Каковы причины повышения активности амилазы в моче?

11. Чему равна норма активности амилазы в крови? В слюне? В моче?

б) Ситуационные задачи (УИРС)

1. Животному внутривенно ввели стерильный раствор сахарозы. Появится ли сахароза в моче?

2. Употребление в пищу кондитерских изделий, конфет вызывает у ребенка рвоту, понос. Он плохо переносит и сладкий чай, тогда как молоко не вызывает отрицательных реакций. Какой молекулярный дефект является причиной данных нарушений?

3. Больной страдает от судорог в мышцах при напряженной физической работе, но в остальном чувствует себя здоровым. Биопсия мышечной ткани выявила, что концентрация гликогена в мышцах этого больного гораздо выше нормы. Почему накапливается гликоген? Ваши рекомендации такому человеку.

4. Клинические симптомы двух форм галактоземии, одна из которых обусловлена недостаточностью галактокиназы, а другая - галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, резко различаются по своей тяжести. И в том, и в другом случае молоко вызывает у больных кишечные расстройства, но при недостаточности галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы нарушаются функции печени, почек, селезенки и мозга, а затем наступает смерть. Какие продукты накапливаются в крови и тканях при недостаточности каждого из двух ферментов? Оцените сравнительную токсичность этих продуктов на основе приведенных выше данных.

5. Сделайте предположение о возможных причинах заболевания, если известно, что у больного, длительно страдающего хроническим заболева-нием кишечника – энтероколитом, после молочной пищи стали появляться метеоризм, диарея, колики.

6. Введение животным адреналина вызывает гипергликемию. Почему это не наблюдается у животных с удаленной печенью?

7. Какие реакции характерны для мобилизации гликогена в печени и мышцах?

1) гликоген → глюкозо-1-фосфат→ глюкозо-6-фосфат→ глюкоза

2) гликоген→ глюкозо-1-фосфат→ глюкозо-6-фосфат

3) гликоген → глюкозо-6-фосфат → лактат

4) гликоген → мальтоза

А. Характерно для печени.

Б. Характерно для мышц.

С. Протекает и в печени, и в мышцах.

Д. Не протекает ни в печени, ни в мышцах.