Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина

Выявление аллельных вариантов гена βLG проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4.

2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Medrano, et al., 1990.

Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:

1. β- LG/HaeIII: 5^/- TGT-GCT-GGA-CAC-CGA-CTA-CAA-AAA-G-3^/

2. β- LG/HaeIII: 5^/- GCT-CCC-GGT-ATA-TGA-CCA-CCC-TCT-3^/ (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) амплифицировали фрагмент ДНКдлиной 247 п.о.

ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 55°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина 10 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1×буфере «G» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение 3 часов.

После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются аллельспецифичные фрагменты: 148 и 99п.о. – для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта.

Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 3,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.

2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Гладырь Е.А., 2001.

Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:

1. β- LG/PvuII:5^/- CTA-TTG-TCC-TCG-TAG-AGG-AAG-C-3^/

2. β- LG/PvuII:5^/- AGA-AAG-CCC-TGG-ATA-AGC-AGC-C -3^/ (Гладырь Е.А., 2001) амплифицировали фрагмент ДНК длиной 1248 п.о.

ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 60°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали по 5 ед. эндонуклеаз рестрикции PvuII и PstI в 1×буферах «G» и «O» соответственно фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение 2 часов.

После обработки продуктов ПЦР рестриктазой PvuII появляются аллельспецифичные фрагменты: 774 и 474 п.о. соответствуют А-аллелю и 774, 297 и 177 п.о. для В варианта. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С по наличию фрагментов - 896, 177.

Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.

2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (GH/MspI)

Для выявления полиморфизма гена соматотропинаMspI-маркеру, с помощью праймеров:

1. GH/MspI: 5^/- CCC-ACG-GGC-AAG-AAT-GAG-GC-3^/

2. GH/MspI: 5^/- TGA-GGA-ACT-GCA-GGG-GCC-CA -3^/ [Mitra A., 1995] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 329 п.о.

ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 62°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.

Для определения полиморфизма гена соматотропина 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MspI в 1×буфере «B» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение 1 часа.

Появление фрагментов – 224 н.п. и 105 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (+) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (-)-вариант.

Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.

2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (GH/AluI)

Для выявления полиморфизма гена соматотропинаAluI-маркеру, с помощью праймеров:

1. GH/AluI: 5^/- GCT-GCT-CCT-GAG-GGC-CCT-TCG-3^/

2. GH/AluI: 5^/- GCG-GCG-GCA-CTT-CAT-GAC-CCT -3^/ [Schlee, 1994] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 223 п.о.

ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 59°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.

Для определения полиморфизма гена соматотропина 3 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции AluI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С в течение 5 часов.

Появление фрагментов – 171 н.п. и 52 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (L) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (V)-вариант.

Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.