Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина
|
|
Выявление аллельных вариантов гена βLG проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4.
2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Medrano, et al., 1990.
Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:
1. β- LG/HaeIII: 5/- TGT-GCT-GGA-CAC-CGA-CTA-CAA-AAA-G-3/
2. β- LG/HaeIII: 5/- GCT-CCC-GGT-ATA-TGA-CCA-CCC-TCT-3/ (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) амплифицировали фрагмент ДНКдлиной 247 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 55°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина 10 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1×буфере «G» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 3 часов.
После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются аллельспецифичные фрагменты: 148 и 99п.о. – для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 3,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLG) по методике Гладырь Е.А., 2001.
Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:
1. β- LG/PvuII:5/- CTA-TTG-TCC-TCG-TAG-AGG-AAG-C-3/
2. β- LG/PvuII:5/- AGA-AAG-CCC-TGG-ATA-AGC-AGC-C -3/ (Гладырь Е.А., 2001) амплифицировали фрагмент ДНК длиной 1248 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 60°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали по 5 ед. эндонуклеаз рестрикции PvuII и PstI в 1×буферах «G» и «O» соответственно фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 2 часов.
После обработки продуктов ПЦР рестриктазой PvuII появляются аллельспецифичные фрагменты: 774 и 474 п.о. соответствуют А-аллелю и 774, 297 и 177 п.о. для В варианта. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С по наличию фрагментов - 896, 177.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (GH/MspI)
Для выявления полиморфизма гена соматотропинаMspI-маркеру, с помощью праймеров:
1. GH/MspI: 5/- CCC-ACG-GGC-AAG-AAT-GAG-GC-3/
2. GH/MspI: 5/- TGA-GGA-ACT-GCA-GGG-GCC-CA -3/ [Mitra A., 1995] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 329 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 62°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена соматотропина 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MspI в 1×буфере «B» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 1 часа.
Появление фрагментов – 224 н.п. и 105 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (+) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (-)-вариант.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (GH/AluI)
Для выявления полиморфизма гена соматотропинаAluI-маркеру, с помощью праймеров:
1. GH/AluI: 5/- GCT-GCT-CCT-GAG-GGC-CCT-TCG-3/
2. GH/AluI: 5/- GCG-GCG-GCA-CTT-CAT-GAC-CCT -3/ [Schlee, 1994] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 223 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 59°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена соматотропина 3 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции AluI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С в течение 5 часов.
Появление фрагментов – 171 н.п. и 52 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (L) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (V)-вариант.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
Date: 2015-11-14; view: 562; Нарушение авторских прав