Подходы для выявления аллельного полиморфизма

Важной характеристикой генетических маркеров является полиморфизм. Генетический полиморфизм – это изменения в нуклеотидной последовательности ДНК маркера, обусловленные различными типами мутаций. Формы проявления генетического полиморфизма получили название аллелей. Наличие двух или более аллелей является необходимой предпосылкой для использования локуса в качестве возможного генетического маркера.

Впервые полиморфизм ДНК был тестирован и использован как генетический маркер в 1974 году при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса [Grodzicker et al., 1974].

Изобретение Кэрри Мюллисом в 1983 одного из основного метода синтеза заданных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов (ПЦР – полимеразная цепная реакция, или PCR – Polymerase Chain Reaction) облегчило и ускорило поиск и идентификацию ДНК-маркеров.

В настоящее время можно выделить два типа маркеров:

· мультилокусные ДНК-маркеры

Идентифицируются на основе ПЦР с праймерами имеющими множественную локализацию в геноме и позволяющие оценивать геномный полиморфизм в целом

· монолокусные ДНК-маркеры

Позволяют оценивать полиморфизм отдельных генов. В этой группе можно выделить ДНК-маркеры, созданные на основе типирования точковых мутаций, микроделеций или микроинсерций, и ДНК-маркеры основанные на анализе микросателлитов [Сулимова Г.Е., 2006].

К наиболее широко распространенным монолокусным ДНК-маркерам относятся маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNP) B микросателлиты.

SNP (single nucleotide polymorphisms) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% [Brookes, 1999].

Возможно существование двух-, трёх- и четырёхаллельных полиморфизмов. Однако на практике чрезвычайно редки даже трёхаллельные SNP (менее 0.1% всех SNP человека [Lai 2001].

Для SNP характерна высокая плотность в геноме. Так, например, в геноме человека однонуклеотидные замены в среднем встречаются через каждые 30 т.п.о. [Lai 2001]. Такая плотность при систематическом анализе способна выявлять проявление полигенных признаков. Помимо высокой плотности, SNPs имеют очень низкий уровень мутаций на поколение (~10^-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции [Crow 1995; Li et al. 1996].

Стандартным методом анализа полиморфизма генов является ПЦР анализ с последующим рестрикционным гидролизом образующихся фрагментов (ПЦР-ПДРФ – полимеразная цепная цепная реакция – полиморфизм дли рестрикционных фрагмениов, или PCR-RFLP – polymerase chain reaction – restriction fragment polymorphism) [Shumm et al. 1988; Saperstin et al., 1991]. Суть метода заключается в амплификации определенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точечную мутацию (SNP – однонуклеотидные замены в геномной ДНК), с последующим расщеплением его соответствующей рестрикционной эндонуклеазой. По длине фрагментов после расщепления делают вывод об отсутствии или наличие точечной мутации, а также о гомозиготности или гетерозиготности по данному аллелю.

Ограничением метода ПЦР-ПДРФ является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции [Сулимова Г.Е., 2006].

Частично эти ограничения можно обойти, поменяв местами этапы амплификации и рестрикции (AFLP - amplification fragment length polymorphism).