Выделение, очистка и концентрирование продуктов ферментации

Выделение внутриклеточных продуктов ферментации часто требует предварительной дезинтеграции клеток, т.е. разрушения клеточных оболочек, что осуществляется одним из следующих методов:

- физическими: механическим измельчением, замораживанием и продавливанием, ультразвуковым воздействием, «паровым взрывом» (декомпрессия);

- химическими – гидролиз под действием реагентов и/или температуры;

- ферментативными методами: ферментолизом – воздействием гидролитических (липолитических, протеолитических) ферментов на клеточную стенку; автолизом, являющимся разновидностью ферментолиза с использованием собственных ферментов клеток, и вызываемым шоковыми воздействиями на клетку.

Процессы выделения, концентрирования и очистки внеклеточных продуктов ферментации из культуральной жидкости носят небиологический характер и относятся к физико-химическим процессам:

- жидкостная экстракция (экстрагентами являются хлороформ, хлорметан, бутилацетат и др.;

- твердфазная экстракция(из биомассы микроорганизмов);

- кристаллизация и перекристаллизация для перевода растворенного продукта в нерастворенное состояние (кристаллы) при охлаждении раствора;

- адсорбция;

- ионный обмен;

- отгонка, ректификация;

- хроматография;

- диализ и обратный осмос для отделения высокомолекулярных соединений от низмомолекулярных через полупроницаемые мембраны;

- микрофильтрация и ультрафильтрация.

Выделение большинства продуктов ферментации из культуральной жидкости, а также их очистка и концентрирование осуществляется по одной из четырех типовых схем (рис. 19).

Рисунок 19 – Типовые схемы выделения, очистки и концентрирования продуктов ферментации

Схема 1 является наиболее простой и служит для получения неочищенных продуктов ферментации для нужд сельского хозяйства и животноводства. Пример: получение товарного продукта антибиотика хлортетрациклина. Его кальциевая соль осаждается из культуральной жидкости при рН>7. Осадок, содержащий клетки гриба-продуцента, внутриклеточный витамин В₁₂ и внеклеточный антибиотик, фильтруют, высушивают, измельчают с добавлением отрубей в качестве наполнителя и фасуют.

Схема 2 предназначена для получения биомассы: живой (пекарских дрожжей, бактериальных удобрений), ослабленной (вакцин), инактивированной (БОО). Пример: для отделения и концентрирования биомассы кормовых дрожжей последовательно применяют следующие методы: флотацию, центробежную сепарацию, вакуум-выпаривание. Далее концентрат дрожжевой биомассы сушат с грануляцией биомассы.

Схема 3 используется для получения эндометаболитов. Выбор методов выделения зависит от свойств метаболитов. Примеры: полиеновые антибиотики успешно экстрагируются органическими растворителями из нативных клеток, а эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток (перепадом давления, УЗИ, ферментолизом).

Схема 4 применяется для получения и очистки экзометаболитов. Выделение начинают при их накоплении в культуральной жидкости около
1,5 % (мас.).

Предварительная обработка необходима для повышения эффективности фильтрования бактериальных суспензий и суспензий актиномицетов, но необязательна для суспензий микромицетов. Для предобработки микробных суспензий используют обработку коагулянтами (FeCl₃, Al₂(SO₄)₃, Na₂SiO₃) и флокулянтами (ПАА-гель, ПАВ) для агрегирования клеток.

Затем культуральную жидкость фильтруют с отделением биомассы, например, в вакуум-барабанных фильтрах.

Экзометаболиты экстрагируют из нативного раствора органическими растворителями, например, пенициллин – бутилацетатом. Выбор экстрагента определяется коэффициентом распределения (К) экстрагируемого вещества. Согласно закону Нернста он определяет соотношение концентраций извлекаемого вещества в экстрагенте и экстрактиве:

К = С _{в экстрагенте} / С _{в экстрактиве}

Для приведенного примера К=35 при рН=2,5 и t =0 ⁰С.

Методы очистки индивидуальны в зависимости от типа экзометаболита.

Пример: выделение и очистка антибиотика канамицина ионным обменом:

1) выделение канамицина на катионитном ионообменном материале:

6 RCOONa + Кан⁶⁺ (RCOO)₆Кан + 6 Na⁺

^{карбоксильный антибиотик}

^{катионит КБ-2 на катионите}

с дальнейшей десорбцией канамицина аммиачной водой:

(RCOO)₆Кан + 6 NH⁴⁺ 6RCOONH₄ + Кан⁶⁺

2) очистка канамицина на анионитном ионообменном материале АВ 17 2П для поглощения пигментных веществ. Канамицин не сорбируется на анионитах и остается в растворе, лишенном примесей;

3) дополнительная очистка на активированных углях марок БАУ или ОУ-А, Б, либо УАФ, УМФ;

4) кристаллизация метанолом (при рН 9,3-9,7);

5) центрифугирование кристаллов;

6) высушивание.

Лабораторная работа 4. Концентрирование и отделение микробной биомассы

Цель и задачи работы: исследовать эффективность концентрирования дрожжевой и бактериальной биомассы в процессе ее отделения от культуральной жидкости различными методами.

Объекты исследования и реактивы:

- микробные суспензии в объеме 500 мл каждая, полученные в результате предварительного суточного культивирования: дрожжей Sacch. сerevisiae и бактерий (например, E. coli).

- растворы флокулянтов (фталоилжелатина, полиакриламид), 1 % (масс.)

- растворы коагулянтов (сульфат алюминия, хлорид железа (III)), 0,5 % (масс.).

Лабораторное оборудование и посуда:

- фотоэлектроколориметр (2 шт.) и кюветы с толщиной рабочего слоя 5 мм

- центрифуга (скорость вращения 1000-8000 об/мин)

- микрокомпрессоры для барботажной флотации, двухканальные, двухрежимные (2 шт.) с аэрационными устройствами (фильтросными патрубками)

- мерные цилиндры объемом 100 мл (по 2-4 шт.)

- стеклянные стаканчики (4 шт.)

- воронки (4 шт.)

- пробирки с резиновыми пробками

- пипетки объемом 1, 2, 5, 10 мл (каждая – 1-4 шт.).

- фильтровальная бумага или фильтры (белая лента)

Задание (рассчитано на его выполнение 4-мя бригадами):

пункты задания предлагается выполнять в следующей последовательности:

1 бригада: 1-3-2-4;

2 бригада: 4-3-1-2;

3 бригада: 3-4-1-2;