Типичная кривая роста клеточной культуры

При занесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис. 1.2) имеет S-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рис.1.2. Кривая роста бактериальной культуры

1.Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

2.Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у некоторых даже 5-10 ч.

Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей. Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

3.Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. И в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

4.Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты. Число живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 4 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необхо­димых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности.

Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Ж. Моно. Субстраты, ограничивающие рост микробных популяций, по­лучили название лимитирующих.

Было показано, что зависимость скорость роста клеточной культуры от концентрации лимитирующего субстрата можно представить в следующем виде:

где N — число микробных клеток; µ_m — коэффициент пропорци­ональности, получивший название предельная максимальная удель­ная скорость роста, K_s— параметр, характеризующий сродство субстрата к клеткам культуры.

Достаточно часто вводят следующее обозначение:

Тогда µ-является коэффициентом пропорциональности, ха­рактеризующим клеточный рост. Его принято называть удельной скоростью роста. Размерность удельной скорости роста - обрат­ное время: мин^-1, ч^-1 и т.д.

На основании литературных данных было показано, что величины варьируют в пределах 10^-2 — 10^-5 с¹, а значения K_s— в диапазоне 10^-2 — 10^-8 М (рис. 1.3). Как следует из рисунка, величины К_г практически полностью соответствуют наблюдае­мым значениям констант Михаэлиса.

Среднее значение µ_т составляет порядка 10^-4 с^-1. Исходя из стандартного соотношения между константой скорости первого по­рядка и временем удвоения численности клеточной популяции, видно, что среднее время увеличения клеточной популяции вдвое составляет около 2 ч.

Рис.1.3. Плотность распределения кинетических параметров ферментных реакций k_кат, К_т и кинетических параметров клеточного роста µ_m, К_S