Получение лимонной кислоты 2 page

Ферменты являются соединениями белковой природы, поэтому в смеси с другими белками определить их количество практически невозможно. Наличие определенного фермента в данном препарате может быть установлено по результатам той реакции, которую катализирует фермент, то есть по количеству образовавшихся продуктов реакции или уменьшению исходного субстрата.

Активность ферментного препарата Е (по международной классификации) выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего в присутствии 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата в заданных условиях за 1 минуту. Число микромолей и будет равно числу стандартных единиц активности.

Необходимо придерживаться определенных условий при установлении активности фермента: вести определение при температуре 30 °С и определять активность по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента.

5.2. Получение ферментных препаратов

из сырья растительного происхождения

Для получения ферментных препаратов пригодны только некоторые растения или отдельные органы растений и животных, способные накапливать значительное количество ферментов. Источники некоторых ферментов приведены в табл. 5.1.

Таблица 5.1

Источники ферментов растительного происхождения

Из ферментов растительного происхождения наиболее широко в пищевой промышленности используют амилазы и папаин. Источником ферментов могут быть пророщенные зерна различных злаков. Условно ферментным препаратом можно считать и ячменный солод, в котором содержится до 1 % амилаз.

Растительная протеаза – папаин – содержится в плодах дынного дерева. Только в США ежегодно расходуют около 1 т папаина для обработки (размягчения) мяса. Папаин, а также протеазы фицин и бромелаин при контакте с мясом в течение 2 ч при комнатной температуре расщепляют белки соединительной ткани – коллаген и эластин.

Из растительного сырья получают также фосфатазы, пероксидазы, уреазы, гемицеллюлазы и другие ферменты.

5.3. Получение ферментных препаратов

из сырья животного происхождения

Органы и ткани животных (поджелудочная железа, слизистые оболочки желудков и тонких кишок свиней и т.п.), содержащие ферменты, на мясоперерабатывающих комбинатах консервируют и используют для получения ферментов. Из слизистой желудка свиней и крупного рогатого скота получают препарат пепсина. Из поджелудочной железы свиней получают панкреатин, смеси трипсина, химотрипсина, липаз и амилаз. Пепсин, трипсин и химотрипсин применяют для размягчения мяса, однако бόльший эффект получен при обработке мяса панкреатином. Из желудка (сычуга) молодых телят выделяют сычужный фермент (реннин), широко используемый в сыроделии. Сычужный фермент осуществляет процесс превращения жидкого молока в гель (сгусток), а кроме того участвует в протеолизе, происходящем в сыре при созревании. Некоторые наиболее известные ферменты животного происхождения, а также органы и ткани животных, из которых их получают, представлены в табл. 5.2.

Таблица 5.2

Источники ферментов животного происхождения

5.4. Получение ферментных препаратов с помощью микроорганизмов.

Номенклатура микробных ферментных препаратов

По экономическим и технологическим соображениям получать ферменты с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. В специально созданных условиях микроорганизмы способны синтезировать огромное количество разнообразных ферментов. Они неприхотливы к составу питательной среды, легко переключаются с синтеза одного фермента на другой и имеют сравнительно короткий цикл роста (16-100 часов). Продуцентами ферментов могут быть различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты. Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, так и мутантные штаммы. Микроорганизмы могут синтезировать одновременно целый комплекс ферментов, но есть и такие, особенно среди мутантных штаммов, которые являются моноферментными и образуют в больших количествах только один фермент. Микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть легко выделены и проявляют свою активность независимо от того, находятся ли они внутри клетки или в культуральной жидкости.

Производство ферментных препаратов осуществляется и поверхностным, и глубинным способами. При поверхностном способе в качестве продуцентов используются грибы. Питательные среды при этом способе имеют твердую или рыхлую консистенцию. Основой почти всех сред являются увлажненные пшеничные отруби. Для придания среде рыхлой структуры и ее обогащения к пшеничным отрубям добавляются древесные опилки или солодовые ростки. Культивирование проводят в условиях аэрации.

Глубинный способ выращивания принципиальных отличий от поверхностного не имеет. Культивирование проводят в жидких средах, а продуцентами могут быть и бактерии.

При получении внеклеточных ферментов применяют питательные среды неопределенного состава. В таких средах в качестве источника органического углерода и азота, как правило, используют различные сорта крахмала (картофельный, кукурузный, рисовый), кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Однако такие питательные среды неприменимы при выделении внутриклеточных ферментов, так как биомасса в этом случае содержит нерастворимые компоненты, затрудняющие выделение и очистку целевого продукта.

Замена одного источника углерода на другой коренным образом меняет набор накапливаемых ферментов. Например, Aspergillus awamori на средах, содержащих крахмал, преимущественно образует амилазы, при замене крахмала на ксилан синтезирует ксиланазу, а если в качестве источника углерода применяют растительное масло, в культуральной жидкости накапливается липаза.

При получении ферментов высокой степени очистки целесообразно культивировать продуцент в питательной среде строго детерминированного (определенного) состава, что обеспечивает направленный биосинтез нужного фермента.

Ферментные препараты представляют собой жидкости (до 50 % сухих веществ), либо порошки. Часто они содержат не один, а целый комплекс ферментов. Выделение и очистка ферментов очень трудоемкий и дорогой процесс, поэтому в некоторых случаях ферментные препараты применяют неочищенными. Но в пищевой промышленности используют препараты высокой и даже предельной степени очистки. Чем выше очистка, тем выше активность препарата. В целом ряде случаев необходимо иметь ферментные препараты, стандартизованные по активности входящих в их состав ферментов. В этом случае используют различные наполнители: муку, крахмал, соли серной и соляной кислот, бентонит и др.

Номенклатура ферментных препаратов микробного происхождения

Существует определенная система названия ферментных препаратов, в которой учитываются: основной фермент, источник получения и степень очистки. Подавляющее количество ферментных препаратов является комплексным, содержащим помимо основного фермента еще значительное количество сопутствующих ферментов и белков. Поэтому в технологии ферментов препараты чаще классифицируют по основному компоненту в смеси ферментов, присутствующих в данном препарате: амилолитические, протеолитические, липолитические и т.д.

Наименование каждого препарата включает сокращенное название основного фермента, затем добавляется видовое название продуцента, заканчивается название препарата суффиксом "ин". Например, амилолитические препараты, получаемые из культур Aspergillus oryzae и Bacillus subtilis, называются соответственно амил-ориз-ин (амилоризин) и амил-о-субтил-ин (амилосубтилин). Мальт авамор ин П2х (продуцент A. awamori содержит в основном мальтазу). Целло вирид ин Г3х (продуцент Trichoderma viride содержит в основном целлюлолитические ферменты).

Далее ставится индекс, в котором обозначены способ производства и степень очистки фермента от балластных веществ. При глубинном способе культивирования после названия ставится буква Г, а при поверхностном - П. После букв Г или П может стоять цифра, обозначающая степень чистоты препарата. Индекс 2х обозначает жидкий неочищенный концентрат исходной культуры; 3х - сухой ферментный препарат, полученный высушиванием распылением неочищенного раствора фермента (экстракта из поверхностной культуры или культуральной жидкости). Технические ферментные препараты с индексами 2х и 3х чаще используются в легкой промышленности и сельском хозяйстве. Для пищевой промышленности, медицины и научных исследований требуются очищенные и высокоочищенные ферментные препараты. Индекс 10х означает сухие препараты, полученные осаждением ферментов органическими растворителями или методом высаливания; цифрами 15х, 18х, 20х обозначают препараты, частично освобожденные не только от балластных веществ, но и от сопутствующих ферментов; выше 20х - высокоочищенные и даже гомогенные ферментные препараты.

В нашей стране выпускаются следующие ферментные препараты: амилосубтилин и протосубтилин (продуцент - Bacillus subtilis), пектофоетидин (Aspergillus foetidus), мальтаваморин (Aspergillus awamori), амилоризин (Aspergillus oryzae), глюконигрин (Aspergillus niger) и другие.

5.5. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности

Протеолитические ферменты продуцируются грибами рода Aspergillus, Penicillium, бактериями рода Bacillus, дрожжами рода Saccharomyces. Эти ферменты используют при переработке животного сырья в мясной, молочной и рыбной промышленности. Они применяются как размягчители мяса, ускорители созревания мяса и рыбы. При проведении слабого протеолиза с использованием набора специфических ферментов происходит незначительное изменение структуры мяса, но оно становится качественно лучше, значительно мягче. Особенно важным является действие ферментов на белки соединительной ткани. В этом случае оказывается возможным значительно полнее использовать все части туши.

Ввиду нехватки сырья для получения сычужного фермента в последние годы ведутся интенсивные работы по поиску его заменителей ферментами микробного происхождения для сыродельной промышленности. Однако все они уступают ему по свертывающей способности. Хорошими сгустителями являются протеазы, полученные из штаммов микроскопических грибов рода Mucor и бактерий родов Bacillus, Pseudomonas и др. В настоящее время в сыроделии применяется около 10 % реннина микробного происхождения.

В пивоваренном производстве протеолитические ферменты применяют для устранения белковых помутнений, а в хлебопечении - для сокращения времени замеса теста из пшеничной муки с высоким содержанием клейковины. Протеолитические ферменты используют как добавки к моющим средствам, что дает высокий эффект при устранении белковых загрязнений.

Амилолитические ферменты продуцируют грибы рода Aspergillus, Penicillium, Mucor и бактерии рода Bacillus. Самыми большими потребителями являются спиртовая и пивоваренная промышленности. Амилазы микробного происхождения добавляют при подготовке пивного сусла, при спиртовом брожении, чтобы перевести крахмал в форму, усваиваемую дрожжами. Тем самым можно ускорить или полностью заменить солодование зерна в пивоварении. Кроме того, амилолитические ферменты применяют в хлебобулочном производстве, способствуя улучшению структуры мякиша хлеба.

Целлюлолитические ферменты, участвующие в гидролизе целлюлозы, представляют собой комплекс, состоящий из нескольких ферментов с различной специфичностью действия: эндоглюканазы, экзоглюкозидазы, β-глюкозидазы и др. Целлюлазы и гемицеллюлазы могут быть получены только с помощью микроорганизмов. Целлюлазы, продуцируемые грибами родов Fusarium, Trichoderma, Penicillium, применяют в спиртовой, пищеконцентратной промышленностях, где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений, например, в производстве растворимого кофе.

Пектолитические ферменты продуцируют грибы родов Aspergillus (Aspergillus niger), Penicillium, бактерии Erwinia caratovora, Clostridium sp. Пектиназы представляют комплекс ферментов, состоящий из полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и др. Эти ферменты используют при производстве осветленных соков из плодов и ягод, для осветления вин. Применение пектиназ в производстве соков обусловлено тем, что они катализируют гидролиз пектиновых веществ растительных клеток, тем самым освобождая сок из клеточных структур. Применение пектиназ в виноделии увеличивает скорость фильтрации сусла, способствует его осветлению и стабилизации. При этом возрастает содержание экстрактивных веществ, витамина С, флавоноидов, обладающих Р-витаминной активностью.

В производстве кисло-молочных продуктов используется реннин - ферментный препарат, осуществляющий свертывание молока. Получают его с помощью микроорганизмов Endothia parasitica и Mucor sp.

Наибольшее распространение получили препараты, в которых ферменты в активной форме прикреплены к нерастворимой основе. Такие ферментные препараты называют иммобилизованными. Преимуществом их применения является возможность многократного использования. В этом случае обрабатываемый раствор пропускают через основу с иммобилизованным ферментом.

Вопросы для самопроверки

1. В чем отличие ферментов от ферментных препаратов?

2. Что такое активность ферментного препарата?

3. Перечислите основные источники получения ферментов растительного и живтоного происхождения.

4. Перечислите, какие микроорганизмы применяют для промышленного производства ферментных препаратов.

5. Какие способы культивирования микроорганизмов используют при производстве ферментных препаратов?

6. Расскажите, по какому принципу составляется название ферментного препарата микробного происхождения.

7. Ферментные препараты какого действия наиболее широко используются в пищевой промышленности?

8. Области применения амилолитических ферментов.

9. В каких отраслях пищевой промышленности используются пектолитические ферменты?

10. Назовите продуцентов и область применения целлюлаз.

11. Что такое иммобилизованные ферменты, в чем их преимущество?

ТЕМА 6. ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

6.1. Получение биомассы микроорганизмов в качестве источника белка

Сбалансировать содержание в кормах белка и его аминокислотный состав можно с помощью биомассы микроорганизмов.

Этот белковый источник имеет ряд преимуществ:

- большая скорость роста микроорганизмов (микроорганизмы растут в 500 раз быстрее, чем сельскохозяйственные культуры и в 1000-5000 раз быстрее, чем самые быстрорастущие породы животных);

- высокое содержание белка в биомассе: дрожжи способны накапливать до 40-50 % белка от своей массы, а некоторые бактерии до 60-70 % белка;

- удовлетворительная биологическая ценность белков: по содержанию большинства незаменимых аминокислот (лизина, триптофана и др.) белок многих дрожжей и бактерий соответствует эталону (яичному белку);

- независимость производства от погодных и сезонных условий: биомассу микроорганизмов можно получать круглогодично;

- возможность выращивания биомассы на различных непищевых субстратах и на отходах ряда производств;

- возможность организации производства микробного белка индустриальными методами с применением автоматизации.

Использование того или иного продуцента при производстве белковых препаратов определяется составом питательной среды и назначением белка. Требования менее строги, если белок предназначен для кормовых целей и должны быть высокими, если белковые препараты используются в пищу.

Эффективность применения микроорганизма-продуцента для производственных целей определяется, с одной стороны, скоростью его роста, с другой - степенью использования питательных веществ среды. Продуценты белков должны отвечать следующим требованиям:

s накапливать 40-70 % белка от своей биомассы;

s максимально усваивать питательные вещества среды;

s не являться болезнетворными и не выделять в среду токсических продуктов;

s обладать высокой устойчивостью и выживаемостью в нестерильных условиях выращивания;

s иметь высокую скорость размножения и роста;

s легко отделяться от среды.

Промышленные культуры, используемые для биосинтеза белковых веществ, должны отвечать медико-биологическим требованиям.

Преимуществом дрожжей перед другими микроорганизмами является их технологичность: устойчивость к инфекциям, легкость отделения от среды благодаря крупным размерам клеток по сравнению с бактериями, способность усваивать различные источники углерода, азота и способность расти на простых средах, высокие питательные свойства и приятный запах биомассы. Дрожжевая биомасса представляет собой полноценный белковый продукт с высоким содержанием витаминов, который может найти применение как для кормовых, так и для пищевых целей.

Преимуществом бактерий является высокая скорость роста, бόльшее, чем у других микроорганизмов, содержание белка и незаменимаой аминокислоты метионина в биомассе. По составу аминокислот бактериальный белок приближается к животному и поэтому имеет бόльшую ценность в качестве кормового препарата. Однако при использовании бактерий должен быть тщательно изучен состав их липидов, так как у некоторых из них в липидах могут содержаться токсины. Недостатком бактерий являются маленькие размеры клеток и плотность, близкая к плотности воды, что затрудняет их выделение из культуральной жидкости.

Кроме того, биомасса дрожжей и бактерий имеет высокое содержание нуклеиновых кислот (до 12 % и до 16 % соответственно), что ведет к образованию нежелательных продуктов распада в животном организме.

Водоросли, как и все другие микроорганизмы, водоросли являются перспективным источником получения белка. Они легко отделяются от субстрата, медленнее растут, чем дрожжи и поэтому содержат меньше нуклеиновых кислот в биомассе. Общее содержание белка в водорослях может достигать 70 %. Причем эти белки полноценны по аминокислотному составу.

Грибы. Для получения кормового и пищевого белка можно использовать промышленное выращивание различных видов низших и высших грибов. Некоторые виды микроскопических грибов способны накапливать до 50 % белка.

По содержанию незаменимых аминокислот белок грибов приближается к белку животного происхождения, биомасса богата витаминами, особенно, группы В, содержание нуклеиновых кислот низкое (2,5 %), клеточные стенки тонкие и легко перевариваются в желудочно-кишечном тракте животных.

При выращивании микроскопических грибов на жидкой питательной среде, как правило, на первой стадии культивирования происходит интенсивное образование биомассы. В условиях глубинного культивирования в первые 5-6 часов происходят сложные внутриклеточные преобразования в конидиях, они набухают, и появляются первые гифы. Далее идет быстрое развитие и рост мицелиальной массы гриба. Мицелий может формироваться в виде шариков или кашеобразной массы.

Промышленное производство микробного белка

Независимо от вида используемого сырья, технологический процесс производства микробных белковых препаратов состоит из следующих основных стадий (рис. 6.1): подготовка сырья и приготовление питательных сред для выращивания микроорганизмов; культивирование микроорганизмов; выделение биомассы продуцента из культуральной жидкости; плазмолиз клеток; сушка

		Сырье
Пар		Подработка сырья (измельчение, гидролиз, освобождение от токсических веществ и т.д.)
Воздух
Кислоты, щелочи и другие химические агенты
Воздух		Приготовление питательной среды
Пар
Питательные вещества
Чистая культура продуцента		Культивирование микроорганизмов
Вода
Пар
Воздух
Вода		Отделение биомассы продуцента от жидкой фазы и ее промывка
Пар		Концентрирование биомассы и плазмолиз клеток
Нагретый воздух		Высушивание микробной пасты до влажности 8-10%
		Фасовка и упаковка готового препарата
		Готовый микробный белковый препарат

Рис. 6.1. Основные стадии процесса производства

микробных белковых препаратов

биомассы; фасовка и упаковка готового препарата.

В качестве питательной среды для производства белковых препаратов в промышленных масштабах используют молочную сыворотку. Более подробно химический состав и свойства молочной сыворотки описаны в разделе 2.3. На молочной сыворотке хорошо растут и накапливают значительное количество белка дрожжи Kluyveromyces и Candida. Большое значение имеет и то обстоятельство, что применение молочной сыворотки не требует специальной сложной подготовки, а культуральная жидкость после выращивания микроорганизмов может быть использована в пищевых и кормовых целях без обработки.

При всестороннем исследовании микробной массы, полученной на молочной сыворотке, была выявлена ее высокая технологическая и экономическая эффективность для мясного и молочного животноводства, птицеводства и целого ряда других направлений.

Для получения белка на гидролизатах растительного сырья наиболее часто используют дрожжи рода Candida, реже - дрожжи рода Trichosporon. Также дрожжи рода Candida способны к синтезу белка на сульфитных щелоках и жидких углеводородах. Газообразные углеводороды хорошо потребляются бактериями родов Mycobacterium и Pseudomonas.

Применение биомассы микроорганизмов в качестве белковой добавки в корма требует всестороннего изучения ее состава и свойств, в частности перевариваемости и усвояемости. Испытанию на токсичность должны подвергаться не только живые клетки, но и продукты их метаболизма, а также готовые белковые продукты. Обязательным условием должно быть отсутствие в них живых клеток штамма-продуцента, чтобы не происходил вторичный рост.

Наиболее эффективным путем использования микробного белка для ликвидации белкового дефицита в питании человека является его применение непосредственно для пищевых целей. Микробный белок используется в пищевой промышленности для изготовления различных продуктов и полуфабрикатов, начиная с 1985 г.

В производстве пищевых продуктов рассматриваются 3 основные формы использования микробного белка:

1. Цельная биомасса (без специального разрушения клеточных стенок).

2. Частично очищенная биомасса (разрушение клеточных стенок и удаление нежелательных компонентов).

3. Выделенные из биомассы белки.

Выделенные белки (изоляты) являются наиболее приемлемыми формами использования белковых препаратов. Однако недостаток их применения связан с тем, что при их выделении используются кислоты и щелочи, высокая температура, давление, что приводит к частичному разрушению аминокислот.

При микробном синтезе белка следует подбирать культуры, у которых состав белка по незаменимым аминокислотам был бы близок к эталону, установленному Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) - яичный белок, белок женского молока.

ВОЗ сделала заключение, что белок микроорганизмов может использоваться в продуктах питания, но допустимое количество нуклеиновых кислот вводимых вместе с микробным белком в диету взрослого человека не должно превышать 2 г в сутки. Испытания на добровольцах показали, что введение микробного белка в пищевой рацион не вызывает отрицательных последствий, но встречается проявление аллергических реакций, желудочные заболевания и т.д.

6.2. Производство хлебопекарных дрожжей и их экспертиза

Дрожжи – постоянный спутник человека, они используются в разных микробиологических процессах. Хлебопекарные дрожжи в России начали выращивать в монастырях еще 14-15 вв. Прессованные дрожжи начали производить в 1972 г. в Германии.

Биомассу дрожжей, как источник пищевого белка, человек применяет только в экстремальных условиях (во время голода или в качестве компонента сухого пайка для альпинистов, мореплавателей). Одной из причин малой популярности дрожжевых блюд является сравнительно толстая клеточная оболочка дрожжей, которая затрудняет их усвоение организмом.

Наши представления о питательной ценности дрожжей постепенно меняются. Человек хорошо овладел искусством выращивания дрожжей в промышленных условиях, биотехнологи освоили технологию выращивания богатой белками биомассы хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на простых синтетических средах (например, на этиловом спирте микробного или химического происхождения), а химики разработали способы выделения из дрожжевой биомассы очищенных белковых концентратов. Хлебопекарные дрожжи могут метаболизировать этиловый спирт благодаря наличию в клетках алкогольдегидрогеназы, но рост дрожжей на этаноле имеет множество особенностей. Стимулирующее действие на этанольные дрожжи в синтетической среде оказывают минимальные добавки аминокислот.

При выращивании хлебопекарных дрожжей на синтетической этанольной среде в лабораторном ферментере при непрерывном режиме с добавкой 0,5 % дрожжевого экстракта достигнута концентрация биомассы в пересчете на сухие вещества 8-9 г/л при выходе 70-75 % от использованного субстрата. Вместо дрожжевого экстракта можно применять кукурузный экстракт или депротеинизированный сок картофеля.

Промышленное производство хлебопекарных дрожжей

Обычно для промышленного производства дрожжей используют питательную среду, основным компонентом которой является меласса – отход сахарного производства (свекловичная или из сахарного тростника). Дрожжи выращивают в биореакторах (ферментерах) периодического действия аэробным глубинным способом при рН 4,4-4,5 по так называемому приточному методу. В чистый аппарат вводят 70-80 % теплой воды от необходимого конечного разведения мелассы (1: 17 – 1: 30, в зависимости от первоначальной концентрации сахаров), добавляют 10 % мелассы и растворы солей, устанавливают оптимальные рН среды и температуру и начинают умеренную аэрацию (1 об/ (об · мин)). В такую среду вносят посевной материал. В течение 1-го часа среду не добавляют, а в последующие 10 ч ее вводят непрерывным потоком в количествах 5; 6; 7,2; 8,2; 9,2; 10,2; 12,8; 11,0 и 9 % в час от общего количества питательной среды. Аэрация в течение всего процесса ферментации также меняется. В первый и последний час культивирования она меньше (1: 1), а в период интенсивного размножения дрожжей достигает 1,5 – 2,0 об / (об · мин). В таких условиях дрожжи проходят все стадии развития. В стационарной фазе роста культуру выдерживают до полного прекращения интенсивного почкования.