Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков)

Принцип данного метода заключается в диффузии антибиотиков из бумажного диска, помещенного на твердую агаровую среду, засеянную испытуемой культурой. Наличие зоны задержки микробного роста вокруг диска и ее размер служат показателями чувствительности данного микроорганизма к противомикробному средству. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска свидетельствует об устойчивости микроорганизма к испытуемому препарату. Диски с антибиотическим препаратом изготовляют из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. В каждом диске создается стандартное количество противомикробного средства, соответствующее требованиям ВОЗ. Диски находятся во флаконе, на этикетке которого указано точное количество антибиотического препарата в одном диске. Флаконы с дисками хранят при температуре от 4 до 20 °С. Когда флаконы с дисками вынимают из холодильника, их, прежде чес открыть, выдерживают в течение часа при комнатной температуре, чтобы предотвратить конденсацию водяных паров. После вскрытия флакона диски с большинством антибиотиков можно использовать в течение 30 дней, а с препаратами пенициллиновой группы – в течение 7 дней.

Расплавленный питательный агар разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Готовые чашки могут храниться при температуре не выше 6°С в течение 7 суток. Непосредственно перед посевом чашки Петри подсушивают в течение 45-60 мин в термостате при 37°С с приоткрытыми крышками.

В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или смыв с суточной агаровой культуры. Бактериальную миллиардную взвесь в объеме 1 мл наносят на агар и равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды покачиванием чашки. Затем чашку наклоняют для стока избытка жидкости, которую удаляют пипеткой.

Перед нанесением дисков чашки Петри подсушивают с приоткрытыми крышками при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Диски с различными антибиотиками стерильным пинцетом плотно накладывают на поверхность засеянной среды. В каждую чашку помещают не более шести дисков на расстоянии примерно 2 см друг от друга и от края чашки, чтобы исключить возможность наложения зон торможения роста от разных дисков. Чашки с дисками инкубируют в течение 18 часов при температуре 37 °С в перевернутом положении, чтобы предотвратить размывание газона конденсационной жидкостью.

Измерение диаметров зон задержки роста проводят с точностью до 1 мм с помощью линейки. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска указывает на устойчивость испытуемого возбудителя к данному антибиотику. При зоне лизиса диаметром до 10 мм штамм расценивается как малочувствительный. Зоны диаметром > 10 мм указывают на чувствительность штамма к данной концентрации противомикробного препарата. По таблице 2 можно количественно оценить степень чувствительности микроорганизма к антибактериальным препаратам в зависимости от диаметра зоны задержки роста и значения МПК.

Таблица 2 – коррелятивная связь диаметра зон задержки роста микроорганизмов с МПК антибиотиков

По рекомендации ВОЗ при определении диаметра задержки роста не учитывают очень маленькие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. В случае образования зон задержки роста с не резко очерченными краями измеряют диаметр только четко выраженной зоны, не принимая во внимание едва заметные колонии.