Посев инокулята

В бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. Для конечного результата является очень важным: как и в какие сроки был взят материал для исследования и где он был засеян (у постели больного или в лаборатории).

Если материал перевозят в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

Для каждой инфекции существует инструктивно-методическая литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

Первым этапом бактериологических исследований является посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащения. Питательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

Посев проводят петлей (материал наносят у края чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал наносят на поверхность агара, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом вносят в чашку, делают площадку и круговыми движениями чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

Для разных целей посевы, например, делают штрихами. Карандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от края чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиваться (обычный посев). Иногда делают посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура) наносят пипеткой на агар и тщательно распределяют по всей поверхности, покачивая чашку. Надписи делают на чашках со стороны дна.

При пересеве из пробирки в чашку Петри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти у корня большого пальца. Петлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. Пробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжигая края пробирок. Вводят петлю внутрь пробирки, прикасаются к краю питательной среды для охлаждения петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не повреждая агар.

Затем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и ставят ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, вводят внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втирая материал, а затем, поворачивая чашку, засевают материал штрихами по секторам чашки. Петлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и ставят в штатив.

При посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. Петлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. Петлю вводят в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, вводят в другую пробирку и производят посев штрихами от нижнего края косяка к верхнему.

Если засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое время в этой среде, чтобы культура могла распределиться в жидкости.

При посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. Затем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и ставят в штатив, а затем ставят и пробирки.

При посеве на скошенный агар, делают штрихи, начиная с нижнего края скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). При посеве на среды Ресселя, Олькеницкого и Клиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

При посеве жидкого материала пользуются пипетками или петлей. При посеве пробы для количественного учета микроорганизмов наносят 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожигая шпатель, переносят его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Лишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С (обычно) или при температуре, оптимальной для культуры. Срок инкубации зависит от скорости деления клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

Изучение изолированных колоний

По истечение определенного срока на засеянных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

Колония - это видимое невооруженным глазом характерное изолированное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засеянных микробных клеток. Это второй этап бактериологического анализа. Морфология выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак. Колонии микробов изучают в проходящем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. Рассматривают чашку со стороны дна.

Оценивают морфологию по определенным критериям:

n размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

n форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

n профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

n характер поверхности (гладкая, шероховатая, морщинистая, изрезанная и пр.),

n прозрачность колонии (прозрачная, мутная, полупрозрачная),

n пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

n структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и пр.),

n края колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

n консистенция колонии (мягкая, сухая, слизистая, сметанообразная, крошковидная),

n тип колонии (круглые, влажные, выпуклые – S-тип, сухие, шероховатые, края неправильные – R-тип, тягучие, слизистые, валик вокруг колонии – М-тип)

На этом этапе часть колонии берут петлей для приготовления мазка. При подтверждении однородности культуру засевают на скошенный агар для накопления и на некоторые среды.

Признаки роста бактерий на жидкой питательной среде:

Рост бактерий на жидкой питательной среде оценивают по нескольким признакам:

1. Наличие пленки (сверху среды, пристеночная и пр.),

2. Наличие осадка (плотный, рыхлый, волокнистый и пр.),

3. Наличие помутнения среды,

4. Комбинация этих признаков.

1. Равномерное помутнение жидкой питательной среды (Shigella и др.),

2. Придонный рост бактерий – осадок на дне. Осадок может быть скудный, обильный, по виду – крошковидный, гомогенный, волокнистый, в виде рыхлых хлопьев, компактный (Cl. botulinum), зернистый (Corynebacterium), войлокообразный (Mycetes), в виде комочков ваты (Bacillus). По консистенции – вязкий, слизистый, хрупкий, пастообразный. Питательная среда над ним может быть: прозрачной (Bacillus) или мутной (Escherichia). Цвет осадка среды определяется пигментами, продуцируемыми культурой. Придонный рост характерен для анаэробов.

3. Пристеночный рост бактерий. Среда прозрачна, а бактерии растут в виде пленки, хлопьев, зерен и пр., прикрепившись к внутренней поверхности стенок сосуда. Снимается с трудом или легко.

4. Поверхностный рост. Этот тип роста характеризуется наличием пленки или едва заметного налета.

а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, едва заметная,

б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая, вязкая, слизистая, прилипает к петле и тянется за ней,

в) пленка плотная, сухая, напоминает кусочек кожи, снимается целиком в виде диска по диаметру пробирки,

г) пленка плотная сухая, сморщенная бородавчатая, разбивается на кусочки, которые погружаются вглубь жидкости.

Рост бактерий в полужидком агаре

Подвижные микробы вызывают помутнение среды.

Они распределяются практически по всей толще среды.

Неподвижные бактерии растут по ходу укола петлей, образуя разные по форме и размерам помутнения среды – в основном конической или цилиндрической формы с вариациями.

Окружающая среда всегда остается прозрачной.

Пигменты микроорганизмов

Цвет колоний определяется пигментами, которые продуцируют микроорганизмы. Патогенные микробы, в основном, пигментов не образуют и в проходящем свете колонии остаются достаточно прозрачными.

Пигментообразующие виды микробов придают колониям разный цвет: фарфорово-белый, золотисто-оранжевый, красный, синий, сиреневый, черный, зеленый, коричневый и пр.

Известны пигменты двух типов: растворимые в воде и растворимые в органических соединениях. Растворимые в воде пигменты окрашивают среду (Pseudomonas aeruginosa). Наиболее распространены в природе такие пигменты как меланины, каротины, ксантофилы. Первые являются нерастворимыми в воде пигментами, синтезирующимися из фенольных соединений. Они защищают микробы от действия токсичных перекисных радикалов О₂. Многие пигменты бактерий обладают антимикробным действием.

Меланиновые пигменты черного и коричневого цвета, продуцируются бактеройдами.

Хинолоновые пигменты дают желтый цвет, продуцируются микобактериями, кокками.

Пирроловые пигменты дают ярко-красный цвет, продуцируют Serratio marcescens.