Сущность метода Грама.

Структура бактериальной клетки. Строение и функции обязательных структур. Простые и сложные методы окраски. Техника и сущность окраски по Граму, ее значение. Примеры грамположительных и грамотрицательных бвктерий.

Клетки бактерий имеют более простое строение, чем клетки других организмов, т.к. бактерии – это прокариоты. У бактерий нет митохондрий, эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, лизосом, пероксисом и пр.У бактерий выделяют обязательные и необязательные органоиды клетки.

Обязательные органоиды: клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), цитоплазма, нуклеоид, мезосомы, рибосомы.

Необязательные структуры: капсула, жгутики, фимбрии (пили), споры, плазмиды, включения.

Клеточная стенка прочная и упругая поверхностная структура.

Функции: 1) придает форму клетке; 2) защита; 3) поддержание осмотического давления; 4) транспорт веществ, питание, деление; 4) антигенность.

Строение клеточной стенки у разных бактерий разное. Клеточная стенка окрашивается по методу Грама. В стенке - три слоя: 1) один слой пептидогликана,состаящего из тетрапептида и гетерополисахарида(гликана),соединных ковалентной связью.; 2) волнообразная наружная мембрана; она соединена с пептидогликаном молекулами липопротеидов; 3) липополисахаридный слой, он не закрывает полностью наружную мембрану. Липополисахариды состоят из трех частей: а) липид А; б) ядро; в) О-специфическая цепь. Липид А погружен в наружную мембрану (придает токсичность – эндотоксин). О-специфическая цепь определяет антигенность (О-антиген).

По отношению к окраске по Грамму различают грамположительные (грам"+") и грамотрицательные (грам"-") бактерии.

Строение клеточной стенки грам"+" бактерий:

1) толстая стенка (15 - 80 нм);

2) несколько слоев пептидогликана (40-90%);

3) есть тейхоевые кислоты;

4) небольшое количество липидов.

Строение клеточной стенки грам "-" бактерий:

1) тонкая стенка (10-15 нм);

2) один слой пептидогликана (5-10%);

3) нет тейхоевых кислот;

4) много липидов (10-20%).

При нарушении образования клеточной стенки (под влиянием лизоцима, пенициллина) образуются протопласты, сферопласты, L- формы.

Протопласты – это бактерии, полностью лишенные клеточной стенки. Сферопласты – бактерии, у которых клеточная стенка частично сохраняется. Такие бактерии внешне не отличаются по форме (шаровидные клетки разной величины), становятся более проницаемыми и осмотически чувствительными, не делятся. L- формы – бактерии, у которых нарушено образование клеточной стенки, но сохраняется способность к делению.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) окружает наружную поверхность цитоплазмы. Строение: двойной слой (бислой) фосфолипидов и белки. Белки находятся на поверхности бислоя и могут частично или полностью погружаться в липидный слой или пронизывать его насквозь. Функции: 1) активный транспорт (транспортные белки-пермеазы); 2) метаболические процессы (синтез клеточной стенки, энергетический обмен); 3) деление клетки; 4) образование спор.

Цитоплазма -сложный раствор с органоидами, заполняющий полость клетки. Функции: объединяет в одно целое нуклеоид и другие органоиды клетки, обеспечивает их взаимодействие и деятельность клетки как единой целостной живой системы.

Нуклеоид – аналог ядра (образование, подобное ядру). Строение: одна кольцевая двунитчатая молекула ДНК (одна хромосома), немного РНК и негистоновых белков; нет мембраны, ядрышка, не делится митозом. Функции: хранение и передача наследственной информации.

Рибосомы. Строение: 50% РНК и 50% белки; имеют округлую форму; две субъединицы (малая и большая). Функция: биосинтез белка. Рибосомы бактерий имеют 70 S (коэффициент осаждения), а у эукариот – 80 S. Поэтому некоторые антибиотики, которые подавляют биосинтез белка на рибосомах, связываются с рибосомами бактерий, но не с рибосомами эукариотических клеток.

Мезосомы. Строение: впячивания ЦПМ внутрь клетки в виде клубков, петель, пластинок, трубочек. В мембранах мезосом находятся ферменты дыхания, пигменты фотосинтеза. Функции: организация и координация ферментных систем в клетке, обеспечивают энергией деление клетки, синтез клеточной стенки, образование спор, секрецию веществ.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, ис­пользуя красители анилинового ряда.Ос­новные красители — генциановый фиолетовый, кристал­лический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин.

сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей. Сложные методы окраски применяют для изуче­ния структуры клетки и дифференциации микроорганиз­мов.

Техника

1. На фиксированный мазок положить бумажку,пропитанную генцианового фиолетового. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 30-60 с.

3. Слить,не промывая водой.Погрузить препарат 96процентный этанол в течении 20-30 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4.Тщательно промыть водой.. Докрасить водным р-ом фуксина-2 мин.

5. промыть водой, высушить Фильтровальной бумагой и микроскопировать

Сущность метода Грама.

ГРАМ"+" бактерииокрашиваются в сине-фиолетовый цвет. т.к.

1) грам"+" бактерии содержат мало липидов, красители хорошо впитываются;

2) в стенке много пептидогликана и есть тейхоевые кислоты – образуется прочный комплекс с красителями (генциановый фиолетовый + йод);

3) после обработки спиртом поры суживаются и красители задерживаются истенка окрашивается в цвет красителей (сине-фиолетовый).

Грам"+" бактерии: стафилококки, стрептококки, бациллы, клостридии, актиномицеты.

ГРАМ"-" бактерииокрашиваются в красный цвет, т.к.:

1) в стенке много липидов и комплекс красителей (генциановый фиолетовый + йод) плохо впитывается;

2) мало пептидогликана и нет тейхоевых кислот - образуется непрочный комплекс с этими красителями;

3) после обработки спиртом поры остаются широкими и красители вымываются;

4) при окраске фуксином стенка окрашивается в цветэтогокрасителя (красный).

Грам"-" бактерии: кишечная палочка, холерный вибрион, спирохеты, риккетсии, хламидии.

.4. Строение и функции необязательных структур бактерий. Микроскопические методы их обнаружения. Суть, значение и применение методов Циля – Нильсена, Бурри – Гинса, Ожешко, Нейссера. Техника иммерсионной микроскопии.

Капсула. Строение: наружный толстый слой слизи определенной формы и упорядоченного строения (микрокапсула – более тонкое слизистое образование, выявляемое при электронной микроскопии).Состоит из полисахаридов или белков (возбудители сибирской язвы и чумы).

Патогенные бактерии образуют капсулу внутри организма хозяина (например, пневмококки, бациллы сибирской язвы). В чистых культурах бактерий капсула образуется реже.

Функции: 1) защита от повреждений и высыхания (капсулы гидрофильны и хорошо связывают воду); 2) защита от фагоцитоза патогенных бактерий в макроорганизме (капсула - признак вирулентности этих бактерий).

Капсулы окрашиваются по методу Бурри-Гинса. Клетки окрашиваются в красный цвет, капсулы бесцветные, тушь создает темный фон (негативное контрастирование).

Жгутики. Строение: тонкие нити, отходящие от ЦПМ. Состоят из фибрилл, покрытых чехлом. Фибриллы состоят из сократительного белка флагеллина. Жгутики прикрепляются к ЦПМ и клеточной стенке специальными дисками (базальное тело). Импульсы в базальном теле вызывают сокращение белка флагеллина и жгутики совершают вращательные движения. Функция: движение клеток.

По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие группы бактерий:

- монотрихи – один жгутик на одном из концов клетки (холерный вибрион);

- перитрихи – 20-30 жгутиков по всей клетке (кишечная палочка);

- лофотрихи – пучок (несколько) жгутиков на одном конце клетки (синегнойная палочка);

- амфитрихи – один или пучок жгутиков на противоположных концах клетки (спириллы).

Жгутики выявляют:

1) метод серебрения по Морозову; 2) в препаратах "раздавленная" или "висячая" капля (витальные - прижизненные препараты); вывод о том, что есть жгутики, делают по подвижности микробов; 3) при помощи электронной микроскопии.

Ворсинки (фимбрии и пили). Строение: поверхностные нити, более тонкие и коротки е, чем жгутики.Состоят из белка пилина. Ворсинки выполняют различные функции.

Ворсинки общего типа покрывают всю поверхность клетки и прикрепляют бактерии к поверхности и к поражаемым клеткам (адгезия), участвуют в питании, водно-солевом обмене. Половые ворсинки или пили участвуют в конъюгации. Их образуют мужские клетки – доноры, которые содержат F-плазмиды.

Включения: гликоген, гранулеза, полиметафосфаты (волютин), жиры, кристаллы солей. Функция: запасные питательные вещества, нерастворимые конечные продукты.

Волютин окрашивается метиленовым синим в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма клетки – голубая. Зерна волютина окрашивают и по методу Нейссера. Они окрашиваются в темно-синий цвет, а цитоплазма – в желтый цвет.

Гликоген раствором Люголя окрашивается в красно-бурый цвет, а гранулеза – в серо-синий цвет. Капли жира растворами судана III окрашиваются в красно-оранжевый цвет. Пары осмиевой кислоты окрашивают жировые капли в черный цвет.

Споры. Образование и строение: образуются внутри клетки вокруг нуклеоида. Нуклеоид покрывается плотной многослойной оболочкой, а остальная часть клетки отмирает. В составе споры мало воды, много липидов. В оболочке содержится дипиколинат кальция, который придает термоустойчивость. Споры имеют различную форму (круглая, овальная) и расположение в клетке. Расположение бывает: 1) центральное (возбудитель сибирской язвы); 2) терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка); 3) субтерминальное – ближе к концу палочки (возбудитель ботулизма, газовой гангрены). Диаметр споры может быть меньше, чем клетка и форма клетки не изменяется (возбудитель сибирской язвы). Но диаметр споры может быть больше, чем клетка, и форма клетки изменяется: в виде теннисной ракетки у возбудителя ботулизма, в виде барабанной палочки у возбудителя столбняка.

Споры образуют не все бактерии, а бактерии с грамположительным типом строения клеточной стенки (фирмикутные бактерии). Патогенные бактерии образуют споры вне организма человека и животных.

Функция: перенесение неблагоприятных условий среды. Споры обладают высокой устойчивостью к действию неблагоприятных физических (высушивание, высокая температура, УФ-лучи, замораживание) и химических факторов (спирты, кислоты и др.). Они находятся в состоянии покоя и сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени (споры возбудителя сибирской язвы хранятся в почве десятки лет). В благоприятных условиях спора прорастает и превращается в вегетативную форму.

Споры погибают в автоклаве при 120° С в течение 15-20 минут и при действии сухого жара (150-170° С) в течение 1-2 часов.

Обычными методами споры не окрашиваются. Споры окрашивают по методу Ожешко. Сущность метода. Используют сильные воздействия для разрыхления оболочки (протравливание HCl при подогревании), сильные красители (5 % карболовый фуксин Циля). Споры медленно воспринимают краску и с трудом отдают ее обесцвечивающим растворам (5 % H₂SO₄), т.е. не обесцвечиваются. Споры окрашиваются фуксином в красный цвет, а вегетативные формы окрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для изучения окрашенных препаратов применяется иммерсионная микроскопия при помощи иммерсионного объектива, дающего большие увеличения (х90). При работе с иммерсионным объективом на препарат наносят каплю кедрового масла, т.к. его показатель преломления близок к показателю преломления стекла (n=1,51).