Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО₂ или Н₂), а при распаде белков - образование щелочей, H₂S, NH₃.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактоз у и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н₂S, NH₃.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н₂S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH₃ – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

Основные принципы культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к питатальным средам. Классификация питательных сред по назначению, их примеры. Состав и назначение МПА, МПБ, кровяного агара, сред Эндо, Левина и Плоскирева.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О₂) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам.

а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;

б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;

в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;

г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;

д) быть стерильными для получения чистой культуры;

е) содержать достаточное количество Н₂О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;

ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH₂ – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) быть прозрачными;

Классификация питательных сред.

По консистенции среды делят на:

а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ);

б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.;

в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;

г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;

д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;

Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100° С и застывают при 45° С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.

По составу среды делят на:

а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;

б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.

По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;

в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Эти среды используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволя ют отличить патогенные микроорганизмы от кишечной палочки

1. Мясо-пептонный агар
К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +120⁰С в течение 20 минут.

2. Сахарный бульон (бульон с глюкозой)
К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +115⁰С 30 минут.

3. Кровяной агар - специальная бактериол. среда, служащая для выделения бактерий (напр., стрептококков) и установления их гемолитической активности. Для приготовления К. а. к расплавленному и охлажденному до 45°С (не выше) 2% МП А добавляют 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека, смешивают и разливают по чашкам Петри, выдерживают сутки в термостате на возможную бактер. контаминацию. К-ру засевают штрихом или бляшкой.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Основные этапы выделения чистой культуры. Работа 1-го, 2-го и 3-го дня по выделению чистой культуры. Методы изучения сахаролитических свойств бактерий. Состав и назначение сред Гисса.

Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.

Выделение чистой культуры – бактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций.

Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток – специальные методы посева:

а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки;

б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий.

Выделение чистой культуры проводят в три этапа:

Первый этап (1-ый день):

а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют;

б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37°С на 24-48 часов.

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция);

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий);

в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37°С 24 часа.

Третий этап (3-ий день): проделывают работу по идентификации (определение вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для определения вида изучают морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства:

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологические и тинкториальные клетки;

в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитических и протеолитических свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа.

По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.).

В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы).

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактоз у и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.