Опыт 1. Количественное определение глюкозы в биологических жидкостях

В организме человека и животных углевод содержатся в значительно меньших количествах, чем у растений (не более 2% от сухой массы), так как основной их функцией является энергетическая. Энергия, выделяющаяся при расщеплении углеводов, аккумулируется в макроэргических связях АТФ и обеспечивает все процессы жизнедеятельностиорганизмов. Углеводы также являются исходными продуктами для синтеза других органических соединений. Из промежуточных продуктов их расщепления, таких как 3-фосфоглицериновый альдегид, пировиноградная кислота (ПВК), ацетил-КоА, в организмах могут образовываться компоненты липидов (глицерин и высшие жирные кислоты), белков (заменимые аминокислоты) и нуклеиновых кислот (пентозы).

Несмотря на постоянное потребление глюкозы из крови тканями и поступление её из кишечника после приема пищи, содержание глюкозы в крови постоянно и колеблется в пределах 3,3–5,5 ммоль/л (60–100 мг/л). Это постоянство поддерживается в результате сложных механизмов регуляции, которые находятся под контролем центральной нервной системы. Важнейшую роль в этой системе играют гормоны. Так, адреналин и глюкагон повышают содержание глюкозы в крови, а инсулин понижает её.

Принцип метода. Для количественного определения глюкозы в биологических жидкостях применяют фотоэлектроколориметрический метод. Он основан на определении степени интенсивности окрашивания раствора, образующегося при взаимодействии глюкозы с ортотолуидиновым реактивом (в 94 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 0,15 г тиомочевины и добавляют 6 мл ортотолуидина). Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы. При помощи этого метода глюкозу можно определить только при отсутствии белков, поэтому их предварительно осаждают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХК).

Этот метод является специфичным и точным. Он даёт возможность определять истинную глюкозу, так как другие редуцирующие вещества (глюкуроновая кислота, аскорбиновая кислота и др.) с ортотолуидиновым реактивом окрашивания не дают. Взаимодействие глюкозы с ортотолуидином выражается следующей реакцией:

O CH₃

½½

C-H N C-H

½ ½

CH₃ H-C-OH H-C-OH

½½ ½½

HO-C-H HO-C-H

½½ ½½

NH₂ + H-C-OH H-C-OH

¾® ½½ + Н₂О ½½

H-C-OH H-C-OH

½½ ½½

CH₂OH CH₂OH

ортотолуидин глюкоза соединение сине- зеленого цвета

Порядок выполнения работы.