Лекарственные препараты на основе олигонуклеотидов

В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные ге­нетические конструкции, возмещающие функ­циональную форму белка, который не синтези­руется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и парази­тарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения та­ких состояний разработаны терапевтические

системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонук­леотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «анти­генным», а тот, который гибридизуется с соот­ветствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрип­ции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединя­ющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируе­мого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими моле­кулами РНК и разрезают их.

В будущем лекарст­венные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «анти­смысловые» олигонуклеотиды.

3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства

«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагает­ся использовать в качестве лекарственного сред­ства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).

Терапевтический эффект синтетических «анти­смысловых» олигонуклео-тидов зависит от спе­цифичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к дейст­вию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последо­вательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тес­тированием набора «антисмысловых» олигону­клеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого про­водят электрофоретическое разделение клеточ­ных белков, в которые включают радиоактив­ную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутст­вии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5'- или 3'-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутрикле­точными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утра­тили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определен­ным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее ши­роко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б ), в результате чего образу­ется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщеп­ляются под действием эндонуклеаз. При гиб­ридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания та­ких олигонуклеотидов — лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефици­та человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонук­леотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3 В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2'-угле­родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысло­вые» олигонуклеотиды и облегчают их связыва­ние с сайтом-мишенью (рис. 3 2 Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сей­час интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмыловых» олигонук­леотидов в клетку можно значительно облег­чить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет ис­пользовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток про­исходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клини­ческих испытаний лечения болезни Крона с по­мощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко вы­раженный терапевтический эффект без замет­ных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у па­циентов с болезнью Крона. Предполагается ис­следовать эффективность этого же олигонукле­отида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе «антисмысловые» олигонуклео­тиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответст­вует стандартам, принятым для лекарственных средств.

Date: 2016-02-19; view: 1013; Нарушение авторских прав