Методы и подходы в селекции

В настоящее время сформировалось четыре основных подхода, используемых в селекционной работе:

1. отбор штаммов, обладающих ценными призна­ками, проявляющимися в конкретных условиях их существования и благоприятствующими выживанию (синтез антибиотика, способность к более быстрому усвоению того или иного питательного вещества); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее при­способленная мутантная форма вытесняет исходную в популяции. Этот подход опирается на естественный ход событий у микроорганизмов в измененных условиях (естественный отбор);

2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроорганизма и поэтому трудно создать условия выращивания культуры, в которых относительно легко удавалось бы выделять штаммы с нужными признаками в естественных условиях. При этом необходимо проверять большое число клонов и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным или небольшим.

Эти методы селекции основываются на использовании спонтанных скачкообразных наследствен­ных изменений генов - мутаций, вызванных процессами рекомбинации генетического материала in vivo (амплификация, конъюгация, трансдукция, трансформация и пр.). Процессы слепого многоступенча­того отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы. Это обусловлено тем, что для возникновения мутаций интересующий ген должен реплицироваться 10^{6 -} 10⁸ раз, однако это вовсе не означает, что любой получившийся мутант будет обладать полезными свойствами. Большинство мутаций неблагоприятны для организма, часто летальны, и лишь ничтожная часть их может способствовать выживанию или повышению выхода целевого продукта. Поэтому методы селекции основанные на отборе естественно возникающих мутантов являются очень длительными, непредсказуемыми и применимы только к организмам с коротким временем жизни и высокой частотой смены поколений (микроорганизмы).

Более эффективен метод ис­кусственного изменения генома, что резко, на много порядков увеличивает частоту мутаций. Таким методом является инду­цированный мутагенез, основанный на использовании мутагенно­го действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алкилирующие агенты, антибиотики и др.), нейтронных, γ -, рентгеновских и ультрафиолетовых лу­чей, ультразвука, темпера-туры, биологических мутагенов (фаги, вирусы, биотоксины). Мутагены вызывают замены и делеции (удаления) оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. По механизму действия все мутагены можно разделить на две группы:

1. Мутагены прямого действия, непосредственно воздействующие на ДНК;

2. Мутагены непрямого действия. Такие мутагены непосредственно на ДНК не действуют, однако они вызывают образование других веществ, которые и вызывают мутации. Например различные виды ионизирующего излучения вызывают образование в клетках пероксидных радикалов, которые в свою очередь повреждают ДНК. Мутагены непрямого действия могут так же повреждать различные специфические белки-ферменты участвующие в процессах репликации и транскрипции гена.

3. Эффективной технологией, позволяющей совместить возможности различных видов мутагенеза и искусственого отбора форм является ступенчатая селекция. Сущность метода состоит в том, что исходную культуру клеток, у которых интересующий человека признак развит в очень незначительной степени, обрабатывают мутагенами различной природы, что обычно вызывает резкое увеличение частоты различных мутаций. Далее среди образовавшихся мутантных форм проводят поиск (скрининг) таких, у которых интересующий полезный признак усилился. Эти клетки отбирают и получают на их основе чистую культуру, которую опять подвергают воздействию мутагенных факторов различной природы. Далее опять проводят отбор наиболее эффективных мутантов. Процедуры мутагенеза и скрининга повторяют необходимое количество раз, добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктивность и др.).

Несмотря на трудоемкость методов селекции, они до настоящего времени не потеряли своего значения для создания высокоэффективных микроорганизмов – продуцентов. Для примера можно указать успехи с селекцией мутантов пеницилинла, исходный штамм которого, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной жидкости. Во время второй мировой войны 1939-1945 гг. ученые вернулись к этому виду гриба и занялись генетико-селекционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивирования Penicillium chrysogenum, был выделен штамм № 1951 с активностью 100ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех производственных штаммов в различных странах мира. Используя селекцию и комбинированное воздействие различными мутагенами (преимущественно – УФ-лучи и алкилирующие агенты), уже в начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, образующий пенициллин в количестве 5000 ЕД и более в 1мл культуральной жидкости. В настоящее время используются штаммы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл среды. В 1983 г. С.Браун и С.Оливер ис­пользовали методы селекции для отбора мутантных штаммов дрож­жей, устойчивых к высоким концентрациям конечного продукта (10 %-го этанола), при культивировании их в непрерывном режи­ме (650 ч). Методами мутагенеза и селекции получены штаммы Eremothecium ashbyii, способные выделять до 1,8 мг рибофлавина в 1 мл среды, и штаммы Brevibacterium ammoniegenes, продуцирующие до 1 г HSKoA на 1 л среды.

4. Искусственное, целенаправленное конструирование геномов с использованием методов клеточной (соматическа, парасексуальная гибридизация, гибридомная гехнология) и генной инженерии (направленный мутагенез).

Date: 2016-02-19; view: 561; Нарушение авторских прав