Получение антибиотиков

В мире ежегодно производится антибиотиков более чем на 20 млрд. долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты. Открытие антибио­тиков произвело переворот в лечении инфекционных заболева­ний. Ушли в прошлое представления о неизлечимости многих бак­териальных инфекций (чума, туберкулез, сепсис, сифилис и др.). Антибиотики применяют в ряде отраслей народного хозяйства (расте­ниеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышлен­ность и др.), где они используются не менее широко, чем в медици­не. Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотех­нологии.

К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и другими микроорганизмами. Антибиотики, продуцируемые растительными объек­тами, называют фитонцидами.

Вопрос о физиологических функ­циях антибиотиков, их месте в метаболизме и процессах эволю­ции окончательно не решен. Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов, поэтому многие из них служат средствами нападения и защиты, т.е. представляют собой своеобразное химическое «оружие» клетки. Однако эти функции у антибиотиков не единственны. Известно, что они могут участво­вать в процессах детоксикации вредных метаболитов, контроли­ровать некоторые стороны обмена веществ и целые процессы раз­вития, например, дифференцировку клеток, служить запасными питательными веществами. Некоторые исследователи рассматри­вают антибиотики как случайные вещества, обладающие полез­ными свойствами, другие считают их реликтовыми молекулами, вытесненными в ходе эволюции продуктами рибосомального син­теза, но и до сих пор сохранившими способность вмешиваться в биохимические процессы.

Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флемингом. Однако лечеб­ные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых анти­биотиков постоянно растет. В 1940г. было известно всего 6 антиби­отиков, а в настоящее время описано более 12000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препара­тов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ. В зависимости от химической природы и ряда других свойств известные антибиотики делят на ряд классов:

1. β-Лактамные (пенициллины, цефалоспорины) составляют более 50 % рынка антибиотиков.

2. Тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин, метациклин).

3. Макролиды (эритромицин, олеандомицин).

4. Аминогликозиды (гентамицин, амикацин).

5. Гликопептиды (ванкомицин, ристомицин).

6. Амфениколы (левомицетин).

7. Линкосамиды (линкомицин).

8. Полиеновые [противогрибковые (нистатин, леворин)].

9. Противоопухолевые (блеомицин) и др.

Большой вклад в установление структуры ряда антибиотиков внесли М.М.Шемякин, Ю.А.Овчинников, В.Т.Иванов, АС. Хохлов, Г.Б.Локшин, М.Н.Ко-лосов, Ю.А.Берлин, Е.С.Есипов, АД.Кузовнов.

По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лактамные, аминогликозиды), вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин), нарушающие способность микро-организмов делиться. По спектру действия различают антибиотики узкого и широкого действия. К последним относят тетрациклины, макролиды, амино-гликозиды, которые особенно полезны в случае неидентифицированных воз­будителей болезни, однако при длительном применении они вы­зывают у пациентов дисбактериоз.

В последние годы достигнуты большие успехи в расшифровке молекуляр-ного механизма действия антибиотиков. Наиболее яркая особенность антиби-отиков - исключительная специфичность их действия. По выражению П. Эрлиха, антибиотики - это магичес­кие пули. Специфика действия их состоит в избиратель-ном подав­лении этими эффекторами одного или нескольких процессов лишь у некоторых микроорганизмов. Это обусловлено тем, что антибиотики бло­кируют определенные метаболитические мишени в клетках. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне раз­личают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий:

1) нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорины);

2) нарушение отдельных этапов процессов трансляции (амфениколы, аминоглико-зиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды);

3) повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин, полимиксины);

4) нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (рифамицины, актиномицин D, противоопухолевые антибиотики);

5) нарушение энергетического обмена (олиглмицин, хлоргексидин).

Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем био­логии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосин­теза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологичес­кие мембраны и др.

Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностя­ми медицинской практики, так и накоплением резистентных форм микроорга­низмов по отношению ко многим широко используемым антибиотикам. Так устойчивость бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам обусловливается наличием в их клетках фермента лактамазы (пенициллиназы). Фермент гидролизует амидную связь β-лактамного цикла в молекуле анти­биотика с образованием пенициллиновой или цефалоспорановой кислоты, которые пол­ностью лишены антимикробной активности:

Специальное изучение объема и потенциала защитных свойств микро-организмов показало, что их резистентность к антибиоти­кам имеет глобальный характер и обеспечивается как разнообра­зием фенотипов резистентности (наличием большого количества различных ферментов, способных разрушать или дезактивировать молекулы антибиотиков), так и разнообразием и стабиль­ностью систем горизонтального генного транспорта (перенос плазмид несущих гены резистентности из клетки в клетку в пределах популяции). Поэтому сейчас глав­ное направление получения новых антибиотиков состоит не в от­крытии новых соединений, а в химической трансформации при­родных молекул для создания полусинтетических антибиотиков, характеризующихся значительно меньшей резистентностью и ток­сичностью, но более широким спектром действия, большим вре­менем жизни, химической и биологической устойчивостью. Другим перспективным подходом является глубокое изучение механизмов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и поиск препаратов ингибирующих ее. Примером таких природных ингибиторов β-лактамаз являются клавулановая и оливановая кислоты. Такие комбинированные препараты, содержащие антибиотик и ингибитор бактериальной резистентности к нему, обладают гораздо более высокой эффективностью.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получе­ния как природных, так и полусинте-тических антибиотиков.

Основной способ получения - на­правленный биосинтез антибиотиков, осуществляется путем культивирования (пря­мой ферментации) подходящего микроорганизма - продуцента. Точный механизм индуцирования пер­вичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, до конца не расшифрован, однако известно, что биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных мета­болитов, начинается в фазе замедленного роста клеточной популя­ции (конец трофофазы) и достигает максимума в идиофазе. Считают, что в конце трофофазы (середина и конец стационарной фазы) в клетках и культуральной среде происходит накопление избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, некоторые из которых выступают в роли индукторов вторичного ме­таболизма, освобождающих гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Другим, важным стрессовым фактором, индуцирующим гены вторичного метаболизма, является резкое уменьшение содержания или полное исчерпание в питательных средах легкоусваиваемого компонента - глюкозы, что заставляет клетки переключаться на усвоение более сложных субстратов (другие моносахариды, дисахариды, полисахариды). Необходимость синтеза большого количества индуцибельных ферментов в условиях нехватки питания и как следствие промежуточных метаболитов, существенно дезорганизует процессы нормального метаболизма и запускает различные механизмы адаптации, в том числе и синтеза антибиотиков.

Специальные опыты показали, что выход цефалоспорина С уменьшается при переходе от использования в качестве источни­ка углерода сахарозы к быстро усваиваемому углеводу глюкозе. Наиболее оптимальной средой для образования антибиотика куль­турой Streptomyces antibioticus оказалась смесь 0,1 % глюкозы и 1 % галактозы. При таком соотношении моносахаридов глюкоза быст­ро утилизируется и микроорганизм переключается на усвоение галактозы, что и инициирует идиофазу.

Биосинтез антибиотиков может дополнительно стимулироваться за счет других стрессовых воздействий (изменение температуры, рН и др.), а так же добавлением в культуральную среду некоторых веществ, которые называют предшественниками. Молекула вещества – предшественника (обычно достаточно простая по строению) может является структурным фрагментом молекулы антибиотика или быть промежуточным метаболитом в его синтезе. Установлено, что синтез этой молекулы является обычно самой медленной, лимитирующей стадией всего многостадийного синтеза молекулы антибиотика.

Например, производство бензилпенициллина в значи­тельной степени стимулируется добавками фенилуксусной кислоты, которая является структурным фрагментом молекулы бензилпенициллина; пропионовая кис­лота и пропиловый спирт инициируют биосинтез макролидов че­рез метил-малонил-КоА; L-фенилаланин - ускоряет образование грамицидина S.

Молекулы предшественника (например, фенилуксусной кислоты) необходимо добавлять в среду культивирования в пе­риод завершения фазы роста культуры микроорганизма – продуцента бензилпенициллина (на 2-3 сутки для 5-суточного процесса).

Еще одним веществом, добавление которого в культуральную среду резко увеличивает выход пенициллинов является α-аминоадипиновая кислота. Это объясняется тем, что многие антибиотики берут свое начало от промежуточных соединений обмена первичных метаболитов, поэтому их биосинтез регулируется путем ретроингибирования. Так, биосинтез пеницил­лина культурой гриба Penicilliumchrysogenum контролируется по принципу обратной связи L-лизином. Этот эффект объясняется тем, что биосинтез как пенициллина, так и лизина осуществляет­ся через общий предшественник α-аминоадипиновую кислоту (см. схему ниже). Торможение лизином первого фермента биосин­теза – гомоцитрат-синтетазы - приводит к недостатку α-аминоадипиновой кислоты, что снижает общий выход антибиотика.

Добавление в питательную среду α-аминоадипиновой кислоты предотвращает ингибирующий эффект лизина и активирует био­синтез пенициллина в присутствие лизина. Кроме ретроингибирова­ния биосинтез многих антибиотиков тормозится высокими концен­трациями своих же антибиотиков. Следует отметить, что в процессе эволюции микроорганизмы выработали различные механизмы защиты от дей­ствия собственных антибиотиков.

Хороший эффект дает ингибирование некоторых конечных стадий биосинтеза антибиотика. Так, при культивировании в условиях дефицита аниона хлора микроорганизм S. аиrео-faciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин, а при ингибировании реакции метилирования им синтезируется деметилированное производное хлортетрациклина.

Другой способ получения антибиотиков (мутасинтез) состоит в использова­нии для их биосинтеза так называемых “блокированных” мутантов, у которых в результате мутации изначально отсут­ствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, веду­щих к синтезу антибиотика. Такие блокированные мутанты не способны образовывать молекулу антибиотика целиком. Получение таких мутантов осуществляется обычно методами генной инженерии и будет более подробно рассмотрено в соответствующем разделе курса. Сущность метода состоит в том, что в питательную среду, где осуществляется культивирование таких блок-мутантов, в идиофазе вводят различные мутасинтоны D* (вещества близкие по структуре соединению D, синтез которого блокирован). Поскольку для ферментов вторичного метаболизма характерна низкая субстратная специфичность, то эти аналоги блокированного предшественника антибиотика могут быть трансформированы ферментной системой клеток блок-мутантов в ана­логи самого антибиотика – вещества E*. Этот процесс носит название мута­ционный биосинтез, или мутасинтез:

Подходящие мутасинтоны могут быть получены методами химического синтеза или биосинтеза.

Большой интерес как исходные вещества (синтоны, билдинг-блоки, темплейты, шаблоны) для синтеза различных модификаций природного антибиотика представляют продукты его неполного синтеза В. Используя методы биотрансформации и химического синтеза в такие молекулыможно вводить разнообразные фрагменты, отличные от того, который имелся в природной молекуле.

Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена спо­собность к алкилированию, образуют аналог предшественника рифамицина β - рифамицин SV, который служит исходным веще­ством для получения многих синтетических рифамицинов (пре­параты для лечения туберкулеза и проказы).

рифамицин В рифамицин SV рифамицин L

Иногда активностью могут обладать и сами продукты неполного синтеза некоторых антибиотиков (получение различных производных эритромицина).

Третий способ – получение гибридных антибиотиков, основан на использовании генетических гибридов продуцентов. В клетках таких микроорганизмов присутствуют ферменты, катализирующие одновременный параллельный синтез нескольких близких по структуре антибиотиков целиком или их отдельных частей. Вследствие низкой субстратной специфичности этих ферментов возможен “перехват” ферментами одного пути синтеза промежуточных метаболитов другого процесса. В результате может образоваться новый антибиотик, структура которого будет близка, но полностью не похожа ни на один из исходных антибиотиков. Примером является синтез различных антибиотиков актинородинового ряда (см. раздел “Генная инженерия”).

Четвертый способ заключается в биотрансформации природных антибиотиков или синтетических структур, с целью получения более активных соединений. Особенно успешны подобные разработки в области биосинтеза полусин­тетических пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неиз­менном виде ядра пенициллина - 6-аминопенициллановой кис­лоты (6-АПК). Структура 6-АПК очень неустойчивой к действию кислот и щелочей, поэтому ее получение путем химического гидролиза пенициллинов приводит к большим потерям продукта и очень невыгодно. Более удобным является гидролиз в мягких условиях природных пенициллинов с помощью специфического фермента - пенициллинацилазы, образующейся с высоким выхо­дом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Именно этот способ наиболее широко применяется сейчас в промышленности. Ацилазы различают по их субстратной специфичности. Поскольку реакции гидролиза амидов и сложных эфиров являются обратимыми, то некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции - процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифициро­ванного пенициллина. Таким путем, а так же используя химический синтез, было получено более 40 000 по­лусинтетических пенициллинов. Во многих слу­чаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин, что значительно удешевляет процесс за счет снижения потерь и уменьшения числа операций:

Так, полученный путем прямой ферментации бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутантного штамма Kluyvera citrophila при рН 7,8 - 8,0 и температуре 40-50 °С. Затем в ферментер вно­сятся клетки другого мутанта - Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия фермен­тации изменяют таким образом (рН 5,0 - 5,5), чтобы ацилаза вто­рого мутантного микроорганизма осуществляла синтез ампицилина:

Получение препаратов антибиотиков сложный и многоступенчатый процесс, который можно свести к следующим основным этапам:

1.изыскание микроорганизмов-антагонистов в природе и выделение их в чистую культуру;

2. изучение спектра действия и определение антибиотической активности выделенных культур;

3. подбор условий культивирования;

4. первичная идентификация антибиотика;

5. выделение и химическая очистка антибиотика, а так же сравнение полученного антибиотика по биологической активности с уже известными препаратами;

6. изучение механизма действия, биологические и клинические испытания;

7. Получение из исходных, природных культур новых более высокопроизводительных штаммов;

8. разработка лабораторной технологии получения антибиотика, создание опытных и пилотных установок;

9. разработка промышленной технологии;

Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и другими микроорганизмами. Некоторые из этих организмов способны продуцировать большое количество антибиотиков. Так, 6 родов филаментозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков, в том числе пенициллин и цефалоспорин, а три рода актиномицетов - 3000 антибиоти-ков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, один из видов которого - S. griseus синтезирует более 50 антиби­отиков. Среди этих микроорганизмов проводится активная селекционная работа по выведению более высокопроизводительных штаммов. Исследования показали, что в процессе образования антибиотиков задействовано зна­чительное число генов. Массовая расшифровка первичной струк­туры геномов микроорганизмов показала, что эта величина равна 1 - 2 %. Например, у Bacillus subtilis число таких генов достигает 2 %. Это обстоятельство затрудняет анализ путей биосинтеза антибиотиков и идентификацию отдель­ных мутаций, способных увеличить выход продукта, а значит, работы в этой области до сих пор идут в значительной степени наугад. Успехи генной инженерии в получении новых антибиотиков и высокопроизводительных штаммов продуцентов, а так же имеющиеся проблемы будут рассмотрены нами в разделе “Генная инженерия.” Однако большинство известных в настоящее время высокопродуктивных штаммов продуцентов антибиотиков все же получено традиционными ме­тодами мутагенеза и селекции.

По объему выпускаемой продукции промышленное производство антибиотиков является одним из самых крупных биотехнологических производств. Процесс протекает в аэробных условиях и является очень энерго- и материалоемким.

Большинство антибиотиков получают путем периодичес­кого глубинного культивирования соответствующего продуцента в аэробных условиях в реакторах большого объема (20-200л). Период культивирования (ферментации) длится 7-10 суток. В последние годы внедряются полунепрерывные и непрерывные процессыферментации. Технология завершающих стадий процесса (очистки и выделения) определяется природой антибиотика, характером производства и целями дальнейшего использования антибиотиков. Для медицинских целей технология выделения и очистки имеет особое значение. Обычно она включает сложные мно­гоступенчатые комбинации различных операций: экстракцию ан­тибиотиков подходящими растворителями, осаждение и перекри­сталлизацию их из разных сред, фракционирование на ионооб­менных смолах, лиофильную и распылительную сушку готовых препаратов. Антибиотики выделяют или в виде сравни­тельно неочищенных препаратов (натриевая соль пенициллина), или в виде высокоочищенных веществ (прокаиновая соль пени­циллина), предназначенных для клинического использования. Вы­ход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.