Индикация и идентификация вируса

Вирусоскопия.ЭМ и ИЭМ в практических условиях не применяются. Из экспресс-методов диагностики наибольшего внимания заслуживает применение гибридизационного зонда. С помощью его (точечной гибридизации) удается дифференцировать два родствен­ных морбилливируса - ВЧ КРС и ВЧ МЖЖ. Дифференциальная диагностика с помо­щью ДНК-зондов помогла идентифицировать вспышку чумы КРС среди популяции баранов в Индии.

Обнаружение специфических телец-включений. В зараженных культурах клеток в цитоплазме одиночных клеток и симпластов появляются сначала мелкие эозинофильные включения округлой формы со светлым ободком вокруг. С увеличением размеров симпла­стов растут объем и число цитоплазматических включений. Последние принимают много­угольную, продолговатую формы или форму кольца, охватывающего ядра симпластов; в ци­топлазме располагается до 10 включений. Вслед за появлением цитоплазматических включений в инфицированных клетках, в том числе и в симпластах, образуются внутриядерные оксифильные включения в количестве 2-4. Хроматиновая сеть ядра нарушается лишь вокруг включений. В некоторых случаях они занимают почти все ядро.

Биопроба. Идентифицировать ВЧ можно биопробой на иммунном и неиммунном скоте. Двух животных вакцинируют сухой вирусвакциной из шт. ЛТ (согласно утвержденному на­ставлению по применению препарата). Через 12 дн вакцинированных и двух невакцинированных животных заражают испытуемым материалом (суспензия селезенки, лимфоузлов и крови). При наличии у невакцинированных животных специфической температурной реак­ции, клинических признаков и отсутствии таковых у иммунных животных биопроба счита­ется положительной. У заболевших или павших животных обнаруживают специфический АГ в РСК и РДП.

РН. Применяют качественную и количественную РН. Для установления специфичности вызываемых вирусом поражений клеток проводят качественную РН, а для определения ко­личества АТ в сыворотке иммунных животных - количественную.

РСК. Применяют для прижизненной и посмертной диагностики чумы с целью выявле­ния АГ в гомогенатах лимфоузлов, селезенки, а также в инфицированной культуре клеток. При использовании РСК с целью идентификации вируса в культуре клеток в качестве спе­цифического и контрольного АГ используют культуральную жидкость с зараженной и неза-раженной культурами клеток.

Предложена упрощенная модификация РСК для определения растворимых АГ ВЧ КРС. АГ готовят из лимфоузлов или селезенки КРС, коз и кроликов. Отмечено, что АГ, подверг­нутые замораживанию - оттаиванию или ультразвуковой обработке, или осаждению сульфа­том аммония или сульфатом натрия, более активны.

Гипериммунные сыворотки для идентификации вируса готовят по методу Скотта. Кровь берут от кроликов, иммунизированных лапинизированиым, авинизированным или ЛТ-вирусами. Такие сыворотки нужны для обнаружения испытуемого АГ в РСК. Положитель­ные сыворотки и соответствующие им контроли (нормальные сыворотки) получают на КРС в возрасте 12-18 мес. От них берут сыворотку до иммунизации (контрольная) и через 21 день после подкожной прививки 100 иммунизирующих доз (позитивная сыворотка). Такая сыворотка обычно в РН реагирует положительно в разведении 1:40 - 1:80. Полученную сы­воротку сохраняют при -20°С и используют в РСК и РН с испытуемым АГ в течение 4-
6 мес. Диагностическую сыворотку для РСК получают также от кроликов, инфицированных, а затем гипериммунизированных ВЧ КРС.

РДП. Реакцию ставят по методу Оухтерлони. Выявление преципитирующего АГ ВЧ в органах больного КРС является ценным диагностическим тестом, поскольку этот АГ регу­лярно появляется в лимфоузлах больных животных, начиная с 1-го дня повышения темпе­ратуры. На 3-й день болезни он выявляется лишь у 50% больных. РДП, как и РСК, дает бы­стрый ответ (через 12-18 ч). Оптимальный срок для взятия проб - период от 4-6 дн после начала лихорадки до появления поражений во рту и диареи. Если нет животного в этой ста­дии болезни, рекомендуют брать образцы от погибшего животного. Для исследования при­годен материал даже от разлагающихся в течение 52 ч трупов, в качестве антител исполь­зуют гипериммунные сыворотки кроликов и КРС.

Заведомо положительные и отрицательные АГ, приготовленные соответственно от больных и здоровых животных, используют в РДП одновременно. Положительную преципитирующую сыворотку получают от кроликов, иммунизированных инфицированными кро­личьими тканями. РСК, РДП, РН и РИГА являются специфичными и эффективными лабо­раторными методами выявления АГ и идентификации ВЧ КРС. Однако данные ученых показали, что аттенуированные штаммы ВЧ КРС в естественных условиях не сти­мулируют продуцирование преципитирующего антигена в тканях животных. Это может быть характерным признаком отличия вакцинного штамма от эпизоотического. В Иране в 1982 г. в зонах, где скот был вакцинирован, у привитых животных не обнаруживали образо­вание преципитирующего антигена. Поэтому в зонах систематической вакцинации скота против данной инфекции диагноз поставить сложно.

ВИЭОФ. Предложен вместо РДП для быстрой диагностики чумы КРС. В качестве ис­пытуемого АГ служит суспензия селезенки и лимфоузлов толстого кишечника КРС и овец, полученных во время вспышки болезни. ВИЭОФ проводят в 0,8%-ной агарозе на вероналовом буферном растворе с рН 8,6. Гипериммунную сыворотку помещают в лунки вблизи анода, исследуемый материал - вблизи катода. Пластины помещают в горизонтальную ван­ночку с охлажденным вероналовым буфером. Линии преципитации образуются через 45 мин при силе тока 6 мА. ВИЭОФ при обнаружении АГ в тканях павших животных он ока­зался в 4-16 раз чувствительнее РДП и позволяет получить результат в течение 40 мин.

РТГА. Разработана для экспресс-диагностики чумы КРС. Если исследуемый материал содержит вирус, анти-ГА связываются, а их отсутствие или нехватку можно потом выявить, исследуя сыворотку в РТГА с использованием гемагглютинина ВК. При отсутствии вируса в исследуемом материале количество АТ остается неизменным. В этой реакции используют родство АГ ВЧ КРС и ВК. Особую ценность она имеет для диагностики случаев заболева­ния, вызванных штаммами с ослабленной вирулентностью.

ИФ. В качестве исследуемого материала используют мазки-отпечатки и гистологиче­ские срезы (селезенка, лимфоузлы, печень, слизистые оболочки ротовой полости и кишеч­ника) из органов и тканей больных животных или инфицированные этими материалами культуры клеток. Возможно применение непрямого ИФ для обнаружения специфического АГ. Четкие результаты получают в случаях, если ФИТЦ-конъюгат изготовлен на основе гамма-глобулина, выделенного ионообменной хроматографией из специфической сыворот­ки. Прямая ИФ позволяет обнаруживать АГ в более ранние сроки: в мазках-отпечатках из органов больных животных через 2 ч, в зараженной культуре клеток - на 1 пассаж ранее по­явления ЦПД - т.е. раньше на 8-10 дн. С помощью прямой ИФ возможно оценивать результаты РН в культуре клеток через 24-48 ч после постановки опыта, тогда как для оцен­ки реакции по ЦПД вируса требуется 6-8 сут. Поэтому прямой метод ИФ признан высоко­специфичным, чувствительным и пригодным для экспресс-диагностики чумы КРС.

РНГА и РЗГА. Обе реакции позволяют дифференцировать сыворотки и АГ при исполь­зовании обработанных дубильной кислотой эритроцитов крови коз. Реакции основаны на адсорбции перекрестных АТ из сыворотки, которая используется в РТГА.

ИФА. ИФА позволяет быстро выявлять АГ ВЧ КРС в патматериале. Наиболее часто АГ выявляли в мазках из поражений слизистой ротовой полости и лимфоузлов. АГ ВЧ наибо­лее часто выявляли у КРС моложе
3 лет, а у буйволов - в более старшем возрасте. В РДП и ИФА результаты совпадали, но последний позволял получить результат через 2-3 ч. Успеш­но вирус определяли в назальных и глазных секретах через 4 дн несмотря на то, что он там содержался в количестве не более 1,75lg
ТЦД_50/МЛ. ИФА оказался более чувствительным по сравнению с выделением ВЧ КРС. Получены компоненты набора для диагностики чу­мы КРС методом твердофазного ИФА, которые обеспечивают обнаружение вирусспецифического АГ (нуклеопротеина) ВЧ КРС в лизатах зараженных клеточных культур и пробах органов больных животных, а также обеспечивали обнаружение АТ в сыворотках больных и переболевших животных. Чувствительность ТФ ИФА при выявлении специфических анти­тел в сыворотках крови больных и иммунных животных (метод ингибирования) сравнима с чувствительностью РТНГА с использованием эритроцитарного диагностикума на основе монАТ к ВЧ КРС.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Для обнаружения АТ используют РН, ВИЭОФ, РРГ и ЕLIЗА. Для серологического исследования берут кровь как можно раньше после установления клинических проявлений и повторно через 10-14 дн. Исследуют парные сыворотки крови не менее чем от 10 животных. ВНА и КСА у животных-реконвалесцентов обнаруживаются через 3-5 дн, поэтому чаще всего применяют РСК и РН. Ретроспективную диагностику чумы КРС проводят в очагах инфекции или при атипичном её течении на вакцинированном поголовье животных, имевших слабый поствакцинальный иммунитет. 4-кратное увеличение титра КСА и ВНА свидетельствует о наличии прошедшей инфекции.

РСК. Применяют чаще всего. На 3-4-й день после снижения температуры у животных обнаруживают КСА в титре от 1:10 до 1:40. На 21-30-й дн достигают максимума и удержи­ваются в течение 3 мес на уровне 1:80-1:160. Через 8 мес титр их составляет 1:20-1:40.

РН. Можно ставить на кроликах, имея лапинизированный штамм. Учитывая дорого­визну этого метода, его используют крайне редко. Реакция в культурах клеток с использова­нием адаптированных к ним штаммов - метод более простой и дешевый. Для выявления и титрования ВНА метод микротитрования не уступает пробирочному, но выгодно отличается от него меньшей чувствительностью к колебаниям дозы. Чтобы избежать цитотоксического и ингибирующего проявления, рекомендуется делать первоначальное разведение сыворотки 1:5. Количественную РН можно проводить в двух вариантах: 1) с постоянной дозой вируса (200-500 ТЦД₅₀) и двукратно возрастающими разведениями сыворотки;
2) с постоянной до­зой сыворотки (разведение 1:5-1:10) и 10-кратными разведениями вируса 10^-1-10^-6.

РТГА. В качестве АГ в этой реакции используют вирус кори.

ЕLISА. Непрямой твердофазный микрометод позволяет обнаруживать АТ к ВЧ КРС. Данные его коррелируют с результатами РН. Считают, что указанный метод можно успешно применять для оценки эпизоотической ситуации и при проведении кампаний по вакцинации животных.

Проведена сравнительная оценка эффективности использования ИФ, ИФА и ВИЭОФ для выявления АТ против чумы КРС у телят, вакцинированных культуральной вирус-вакциной против чумы КРС. Исследования проведены с использованием первичных куль­тур бычьей почки, выращенных на покровных стеклах и инфицированных шт. К90 ВЧ КРС, или с использованием мазков-отпечатков ткани лимфоузлов КРС, зараженного шт. Гиссар. При применении ИФА мазки-отпечатки предварительно обрабатывали антипероксидазной сывороткой для удаления эндогенной пероксидазной активности клеток лимфоузлов. Уста­новлено, что в первые 7 нед после вакцинации у телят удавалось выявить АТ в 100% случа­ев всеми испытуемыми методами. В последующий период (с 8 до 12 нед после вакцинации) наиболее эффективным был метод ИФ (АТ выявлены у 84,6-100% телят). Менее чувстви­тельными в этот период были методы ИФА и ВИЭОФ (соответственно АТ обнаружены у 23-77,7 и 7,7-77,7% телят). Для определения АТ к ВЧ КРС в Индии успешно применяют ме­тод micrоЕLISА. Показаны преимущества конкурентного ЕЫЗА со специфическими монАТ над непрямым ЕLISА.

Реакция радиального гемолиза (РРГ). Рекомендована для обнаружения АТ к ВЧ КРС. В качестве АГ используют суспензию лимфоузлов от зараженных телят. Реакцию ста­вят на пластинках, куда вносят 2-4 мл 1%-ной агарозы с 0,3 мл конъюгированных с АГ ба­раньих эритроцитов, обработанных хлоридом хрома и 0,3 мл неразведенного комплемента.

Дифференциальная диагностика. Проводится по данным исследования вируссодержащего материала (гибридизационным тестом, биопробой, серологическими реакциями с видоспецифической сывороткой). В связи с тем, что в некоторых странах, в том числе и в европейских, чума КРС давно ликвидирована, при случайном заносе она может быть оши­бочно диагностирована как вирусная диарея или злокачественная катаральная горячка, что необходимо иметь в виду при дифференциальной диагностике чумы.