Серологическая идентификация. ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и изме­ненных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей

ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и изме­ненных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Непрямой вариант испытывали на концентрате с 80% живых лейкоцитов. В качестве AT применяли сыворотку больной лейкозом коровы и меченную ФИТЦ кроличью сыворотку против глобулинов быка. При микроскопии препаратов отмечена флюоресценция на поверхности лимфоцитов в виде яркого светящегося кольца или кольца из пунктиров. В препаратах из лейкоцитов здоровых животных подобного свечения не наблюдается или оно слабо выражено в некоторых клет­ках. Для объективной оценки препаратов рассчитывается индекс флюоресценции (ИФ) по формуле ИФ = (А - В): А, где А - процент несветящихся клеток в контроле; В - процент не­светящихся клеток в опыте. Положительной считается реакция, если ИФ свыше 0,2; сомни­тельной - 0,11-0,2; отрицательной - ниже 0,1.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. У животных, зараженных ВЛ КРС, вырабатываются AT к вирусным АГ, которые выявляются с помощью серологических реакций. Характерной особенностью инфекции ВЛКРС у КРС является, как правило, по­жизненная персистенция вируса и вирусспецифических AT у больного животного. Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных AT являются наиболее практичными, экономичными и широко используемыми в диагностике онковирусной ин­фекции у КРС. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных старше 6 мес, так как у телят, выпаиваемых молозивом и молоком инфицированных ВЛКРС матерей, появляются пассивно приобретенные материнские AT, которые могут персистировать до 6-мес возраста. У зараженных животных в крови циркулируют AT к нескольким структурным белкам вируса. Однако диагностическое значение имеют AT против gp51 и р24 ВБЛ. Количественные соотношения AT анти-р24 и aнти-gp51 могут коррелировать со стадией инфекционного процесса, но при этом, AT к gp51 появляются раньше и содержатся в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, на­правленные на выявление aнти-gp51 - AT по со своей чувствительности будут превосходить аналоги, в которых используется в качестве АГ р24.

В научно-исследовательских лабораториях для обнаружения специфических AT исполь­зуются РН, подавления раннего и позднего поликариоцитоза, нейтрализации псевдотипов и радиоиммуноанализ (РИА). Однако, для эпизоотологического обследования, контроля и борьбы с ВБЛ-инфекцией широко применяют РИД и ИФА, для постановки кото­рых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Все вышепере­численные методы предназначены для выявления AT в индивидуальных пробах сыворотки. Для обнаружения AT в низких титрах, например, в индивидуальных пробах молока или в сывороточных пулах, или в образцах, полученных из молочного танка, требуется высокая чувствительность РИА или ИФА. Разработан ряд серологических реакций для диагностики инфекции, таких как РИФ, РСК, РДП в геле, реакция агглютинации латекса (РАЛ), ELISA, РНГА и реакция нейтрализации псевдотипа (РНПТ).

РДП. Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта ре­акция получила наибольшее применение с гликопротеинным АГ ВЛКРС. Из вируса, осаж­денного методом ультрацентрифугирования культуральной жидкости краткосрочных куль­тур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обра­ботанного эфиром, получают АГ, который используют в РДП. С помощью этого АГ в сыворотках крови инфицированных ВЛКРС животных выявляют ПА к внутреннему полипептиду вируса р24. РДП с гликопротеидным АГ - более чувствительный метод выявления инфици­рованных ВЛКРС животных, чем РДП с полипептидным АГ. РДП (РИД) в геле агара, на­правленная на выявление aimi-gpSl AT, используется в качестве основного диагностическо­го теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными живот­ными, спермой и эмбрионами. При первичном обследовании сывороток крови одной РИД считается достаточно для объявления стада свободным от ВБЛ-инфекции. РИД приме­няется в системе противолейкозных мероприятий в неблагополучных хозяйствах.

Специфические ПА к ВЛКРС появляются через 2 мес после инфицирования и сохраня­ются пожизненно. Для постановки РДП используют диагностический набор, в состав кото­рого обязательно должны входить специфический АГ ВЛКРС, специфическая положительная сыворотка крови КРС. Реакцию ставят макро- и микрометодами. Для изготовления АГ используют клеточную линию FLK-BLV. Из культуральной жидкости вирусный АГ выделяют методом преципитации сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Но наиболее технологичным методом выделения вирусного АГ считают ультрафильтрацию на полупроницаемых мембранах. На результат реакции иммунодиффузии влияют многие факторы: ка­чество АГ и контрольных сывороток, количественные соотношения АГ и AT, качество ага-pa, pH и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними. Для постановки РИД выпускают диагностические наборы: Государственная Курская биофабрика (Россия); PITMAN-MOORE INC., Вашингтон (США), BEHRINGWERKE AG., Марбург (ФРГ), MERIEUX6 Лион (Франция), BIO-VETA NITRAA (Словакия) и др.

Перечисленные диагностикумы представляют собой наборы, состоящие из 2-8 препара­тов. Обязательными компонентами каждого набора являются препараты тест-системы: ви­русный АГ и антисыворотка, которые в результате специфического взаимодействия АГ (gp51 ВБЛ) и AT в процессе диффузии формируют в геле агара нерастворимый комплекс в виде опалесцирующей полосы. Дополнительно наборы могут комплектоваться сухой соле­вой смесью агара, стерильным разбавителем для вирусного АГ и контрольными сыворотка­ми, которые поставляются в жидком или лиофилизированном виде. В последнем случае на­боры комплектуют соответствующими разбавителями контрольных сывороток. Наборы рас­считаны на 90-500 исследований и содержат 3-5 мл вирусного АГ.

РИД проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-HCl или боратном буфе­рах в диапазоне рН 7,2-8,6, содержащим 8-8,5% NaCl. Методика постановки реакции оди­наковая для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок АГ, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Принято 2 стандарта на диаметр лу­нок и расстояние между ними: 1 вариант в странах ЕЭС, тогда как в США, Канаде и стра­нах СНГ приняты параметры, соответствующие второму варианту.

Таблица 104 - Параметры лунок, рекомендуемые для постановки РИД

Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностиче­ский набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке Е-1; референтная сыворотка Е-4, раз­веденная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как поло­жительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Рефе­рентные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Да­нии (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагно­стических наборов для постановки РИД и ИФА.

Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки кро­ви которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС.

Описаны модификация метода иммунодиффузии - усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления AT и АГ ВЛКРС. Со­временная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекоменда­ций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежно­сти результатов югославские исследователи уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста.

Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ. Молдав­скими исследователями показано значительное преимущество РИД при исследовании молозива: титр AT был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови; исследовать необходимо первые порции молозива. Аналогичные данные получены сотрудниками ВИЭВ. Титр AT к gp51 и р24 ВЛ КРС сразу после отела был наивысшим - 1:2187-1:59049 в ИФА и 1:16-1:512 в РДП. Через 1 сут титр AT составлял 25% от исходного.

РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использовать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями. Животные, сыворотки крови которых дали положительную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Данная реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов. Испытание этой реакции показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологическими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС.

ИФ. Менее широко применяют для обнаружения AT в сыворотках крови инфицирован­ных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, иронически инфицированные ВЛКРС.

РНГА. Является чувствительным методом обнаружения AT в сыворотке крови и молоке. Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока. Наибольший Процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследо­ваний был отмечен в РНГА.

ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широко­масштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше, чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувст­вительность серодиагностики по сравнению с РДП. Он удобен для систематического кон­троля молока коров благополучных хозяйств.

ELISA с монАТ ставят с пулом сывороток крови, объединенных от животных одного стада. Предложено выявлять инфицированность ВЛКРС по наличию AT в молозиве коров ELISA. Все образцы молока, взятые от больных коров, позитивных по AT к вирусу в сыво­ротках, оказались положительными. Во ВНИИВиМ получены 6 гибридом, секретирующих монАТ к ВЛКРС. На основе мон AT к gp51 предложен "сэндвич" вариант ИФА для выявле­ния вирусного АГ. Установлено, что структура и доступность антигенных детерминант варьирует в разных системах титрования. Внесение радиоактивной метки может изменять конфигурацию АГ сайтов, что сказывается на результатах исследования сывороток. Анти ВЛ КРС AT конкурировали со специфическим пероксидазным конъюгатом на основе монАТ за связывание с gp51.

Первым этапом в постановке "классического " варианта ИФА для выявления AT против ВЛКРС является непосредственное покрытие лунок микропанелей вирусным АГ. При этом получают большой процент ложноположительных результатов из-за неспецифического взаимодействия невирусных компонентов АГ с испытуемыми сыворотками. Более того, ис­пользование очищенных вирусных белков в качестве АГ экономически неоправданно и не позволяет получать стандартный препарат, что сказывается на воспроизводимости результа­тов ИФА. Поэтому в настоящее время почти все наборы для постановки ИФА изготавлива­ются с использованием захвата AГ AT, сорбированными на стенки лунок микропанелей. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции.

Этап I. Реагенты для захвата АГ: а).монАТ против gp51; б).монАТ против р24; в).Поликлональные AT (gp51+p24) КРС. Этап 2. Антиген:
а) надосадочная жидкость после культивирования клеток FLK-BLV;
б) культуральная жидкость, содержащая продукты генов env или gag ВЛКРС, экспрессируемые рекомбинантными векторами. Этап 3. Испытуемые сыворотки. Этап 4. Реагенты для обнаружения иммунного комплекса.

Непрямые варианты ИФА: монАТ против бычьего IgG; полиАТ против бычьего IgG.

Конкурентный или блокирующий варианты ИФА: а) монАТ против gp51 (направленные против других эпигонов нежели использованных на этапе 1a); 6) Бычьи поликлональные AT (такие, как на этапе 1в)

Этап 5. Цветная индикация. Реагенты для индикации иммунного комплекса (этап 4) можно метить биотином или ферментами, чаще используют пероксидазу хрена. При поста­новке ИФА каждая микропанель должна содержать лунки, заполненные положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

ИФА позволяет выявлять AT в титрах в 10-100 раз меньших, чем обнаруживает РИД. Все коммерческие наборы ИФА должны быть стандартизированы по референтной сыворот­ке Е-4. Причем, процедура стандартизации предусматривает 3 возможных варианта исполь­зования наборов ИФА для исследования: 1) индивидуальных проб сыворотки; 2) индивиду­альных проб молока; 3) пулов сыворотки и молока.

Поскольку в молоке AT к ВЛКРС в 25 раз больше, чем в сыворотке крови, модифици­рованный ELISA должен обладать высокой чувствительностью. При диагностике лей­коза КРС качество используемых диагностикумов имеет первостепенное значение. Наиболее пригодным для ИФА в качестве АГ являются препараты вируса, полученные 2-кратным вы­сокоскоростным центрифугированием и синтетический пептид. В Швеции разработан ELISA для исследования молока и сывороток крови. В Бельгии рекомендован конкурент­ный ELISA с использованием монАТ и меченного пероксидазой конъюгата анти-gpS 1. МонАТ Д9 и F11 против лимфоцитов больных лейкозом животных связываются с АГ лим­фоцитов крови больного КРС, «не распознают» АГ, ассоциированные с лейкозом. ELISA с использованием монАТ, превосходит непрямой тест ELISA.

Параллельно с ИФА AT определяли РИД и электрофореза в полиакриламидном геле. Чувствительность ИФА, испытанного в 5 лабораториях Германии, составляла в среднем 97,6%, что в 4 раза выше РИД. Специфичность ИФА равнялась в среднем 98,1 %. При использовании АГ из культуральных жидкостей клеток почки эмбриона ягнят, персистентно инфицированных ВЛКРС в положительных сыворотках с помощью иммуноблотинга, обна­руживали AT к р24, р15, р12, pl0, gp30, и gp51. В иммуноблотинге оказались активными монАТ к р24 и gp51. Данный метод оказался более чувствительным, чем иммунодиффузия в агаровом геле и ИФА. В ИФА возможно использование синтетических пептидов -фрагментов структурного гликопротеина gp51, синтезированных во ВНИИЗЖ.

Аллергическая реакция. Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберку­леза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного узла (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще поражения в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжееч­ных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильт­раты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лим­фоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди них гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бакте­рии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА и аллергической пробы.