Серологическая идентификация. РИФ. Техника постановки ее такая же, как и при диагностике аденови­русной инфекции крупного рогатого скота

РИФ. Техника постановки ее такая же, как и при диагностике аденови­русной инфекции крупного рогатого скота. Обращают внимание на свечение антигена в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из пре­пуция - через 48, из носа и трахеи-через 72 ч после заражения. Присутст­вие специфического антигена удается подтвердить заражением культуры кле­ток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цптоплазматическая флюоресценция, свойственная ринотрахеитной инфекции. Использование культуры клеток почки кролика позволяет освобо­диться от неспецифического свечения.

Совпадаемость результатов РИФ и патогистологических изменений состав­ляет 87%, а иммунофлюоресценции и вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпа­дали в 94% случаев.

В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев.

Таким образом, РИФ можно использовать для экспресс-диагноз диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами.

РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и по­ложительной нммунофлюоресценции проводят окончательное типирование ви­руса в РН. Перед ее постановкой специфическую и отрицательную сыворотки разводят в соотношении 1:10 раствором Хенкса или питательной средой для кулыуры клеток, содержащих ангионотики, и прогревают в водяной бане 30 мин при 56 °С. РН ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК.

Результаты РН учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной (контроль­ной) сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД ₅₀/мл.

Затем вычисляют индекс нейтрализации (И) по формуле И = Т₁ ^: Т_2,

где Т₁ — титр изолята в присутствии контрольной сыворотки; Т₂ — титр изо­лята в присутствии специфической сыворотки.

Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg. При индексе нейтрализации от 1 lg до 2 lg реакцию счи­тают сомнительной, в этом случае ее повторяют. Индекс нейтрализации менее 1 lg считают отрицательным. При положительных результатах РН изолят счи­тают полностью идентифицированным.

Приготовление гипериммунной сыворотки для РН. Гипериммунную вируснейтрализующую сыворотку готовят по следующей схеме: подкожно вводят кроликам 1 мл культурального вируса с адъювантом Фрейнда, далее следует трехкратное внутривенное введение вируса в объеме 1 мл с интервалом че­рез 7 дней. Через 10 дней после последней инокуляции вируса кроликов обес­кровливают, сыворотку замораживают и хранят при минус 30 °С.

РТГА. Ставят ее микрометодом при 4 °С с 0,5 — 1%-ной взвесью эритро­цитов белых мышей, разбавитель — трис-буферный раствор с 0,2% бычьего сывороточного альбумина. В качестве антигена используют культуральную вируссодержащую жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацент­рифугированием.

После обнаружения гемагглютинирующего агента, определения его гемагглютинирующего титра готовят 4 ГАЕ и проводят его идентификацию в РТГА с эталонной положительной сывороткой.

Иммуноферментная идентификация вируса. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взя­тых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из легочных

смывов.

Кроме того, рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод (НАИП) для лабораторной идентификации вируса ИРТ. Ме­тодика заключается в следующем: на покровных стеклах, в пробирках готовят чувствительную культуру клеток к вирусу ИРТ (ПЭК, ТБ и др.) по общепри­нятой методике. Монослой заражают исследуемым вирусом. Через 48 ч стекла с инфицированными клетками извлекают, отмывают в фосфатно-буферном растворе с рН 7,2-7,4 и фиксируют в охлажденном ацетоне 5-10 мин.

На фиксированный монослой клеток наносят 1-2 капли смеси из специ­фической иммунной сыворотки и комплемента морской свинки в разведении 1:10. Перед работой противовирусные сыворотки сорбируют гетерологичными исследуемыми вирусами, т. с. получают моносыворотки. При обработке контрольных препаратов на монослой наносят смесь комплемента и нормаль­ной сыворотки.

Препараты инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 40-60 мин, затем промывают проточной водой 5-10 мин, слегка подсушивают и обраба­тывают меченной пероксидазой антикомплементарной сывороткой (1-2 кап­ли), предварительно разведенной 1:20 фосфатным буфером, и снова помещают препарат на 40-60 мин во влажную камеру при 37 °С. Затем их промы­вают, подсушивают и для выявления образовавшегося комплекса (антигенан-титело-пероксидаза) на препарат наносят на 40-60 мин бензидиновый реагент (50 мг бензидина в 100 мл трис-НС1-буфера с рН 6,8 с добавлением после фильтрации 6-7 капель 3%-ной перекиси водорода на каждые 5 мл рабочего раствора). Препарат выдерживают во влажной камере, промывают в дистил­лированной воде, высушивают, монтируют на предметном стекле и изучают в световом микроскопе под объективом с иммерсией.

При световой микроскопии непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод обеспечивает четкое выявление вирусного антигена в цито­плазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет обра­зований, которые видны при увеличении в 140 раз.

Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке пере­крестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными антителами эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: антиген реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в культуре кле­ток ПЭК и LF не выявляется.

Непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота.

При использовании иммунопероксидазного метода для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК антиген выявляется через 18, 22 ч после зара­жения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных антигенов (РИФ, иммунопероксидазный и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Вирусный антиген обнаруживают в носовых смывах методом ELISA с 3-го по 10-й день после заражения. В конъюнктивальных смывах его выявля­ют на 5-е сутки.

Идентификация вируса ИРТ посредством рестрикционного анализа вирусной ДНК. Описаны метод клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, который позволяет определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРТ в про­бах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение виру­са в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Антитела к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагно­стики учитывают по возрастанию титра антител в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин.

РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток 'ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Для этого сухой вирус ИРТ из набора диагностикумоя стерильно разводят в объеме, указанном на этикетке, и готовят из него деся­тикратные разведения от 10^-1 до 10^-6 на питательной среде (конечный титр су.хого вируса указан на этикетке).

Разведение готовят в общем объеме 5 мл, затем заражают по 4 пробирки с культурой клеток, предварительно отмытой от ростовой среды, каждым раз­ведением вируса в объеме I мл. Зараженные и контрольные культуры клеток (4-6) инкубируют при 37 °С, ежедневно учитывают ЦПД вируса заклю­чительно — на 5-7-е сутки.

Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур клеток, который высчитывают по методу Рида и Менча пли Кербера и выражают в ТЦД₅₀/мл. Титры 1:32, 1:64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРГ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН.

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U -образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные – 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров АТ в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. С помощью данной реакции легче и быстрее, чем РН проводить типирование АТ к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН.

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить по парным сывороткам. При выявлении ПА кровь лучше брать на 8-й и последуюшие дни болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки.
4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРГ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью данного метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных. В ФРГ разработан и применяется метод ТРАХИТЕСТ для ИФА проб сборного молока поров с целью диагностики скрытого вирусоносительства.

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ран­ние AT IgM выделены на 6-й дн после заражения, к 9-му дн происходил рост титра AT Ig, a к 13-му дн - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревмато­идного фактора может привести к ложноположительным результатам диагностики в IgM-ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позво­ляет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРТ, особенно у молодых животных. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РНГА составляла 98,3%, a EL1SA с ИФ - 95,7%.

ELISA с использованием монАТ. Основан на конкуренции между AT сыворотки кро­ви КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитрационных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРТ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20°С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРТ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется AT сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специ­фичнее РН.