Выделение и идентификация культуры возбудителя

Культивирование. Возбудитель — микроаэрофил (10% СО₂), температурный оптимум 36-37° С (диапазон 30-42° С), рН 7,2-7,6; на обычных средах не растет, на кровяном и сывороточном агаре не растет или рост очень слабый; хорошо культивируется на «шоколадном» агаре, но зависимости от присутствия V-или Х-ростового факторов не проявляет. В условиях обычной атмосферы или в анаэробных условиях возбудитель растет плохо. Материал дробно высевают на «шоколадный» агар в чашках Петри. Используют для изготов­ления среды кровь лошади. Поскольку материал содержит сопутствующую микрофлору, целесообразно проводить посев на селективные среды со стреп­томицином, амфотерицином и кристаллвиолетом. Возможно выделение стрептомициночувствительных штаммов, поэтому рекомендуется посев произво­дить одновременно на две селективные среды: «шоколадный» агар со стрептомицином и «шоколадный» агар с амфотерицином и крисгаллииолетом (Тей­лор К. и соавт., 1978).

Посевы инкубируют при 37° С в атмосфере 10% СО₂ Макроскопически видимый рост обычно появляется через 48 часов, но иногда позднее, поэтому в отрицательных случаях посевы рекомендуется выдерживать до 7 суток.

На «шоколадном» агаре через 2-4 суток инкубирования в оптималь­ных условиях формируются круглые, выпуклые, с блестящей поверхнос­тью и конусовидным центром полупрозрачные колонии, первоначально диаметром 0,25-1 мм, позднее — до 1,5-3 мм, цвет колоний от светло-кремового до коричневого.

На кровяном агаре колонии имеют диаметр 0,3-1 мм, цвет от светло-белого до коричневого, заметна зона ά-гемолиза, которая отчетливо видна только на 5-7-й день культивирования. Гемолитическая активность в боль­шей степени проявляется при использовании эритроцитов лошади и в мень­шей — овцы.

Характерна консистенция колоний на плотных питательных средах. При надавливании бактериологической петлей колонии скользят по поверхнос­ти среды. После помещения бактериальной массы старых культур в воду образуется гель, что заметно при изготовлении мазков для окраски по Граму.

В жидких питательных средах (сердечно-мозговой бульон) на 3-4-е сутки инкубирования рост возбудителя проявляется легким помутнением среды.

Морфология клеток возбудителя в культуре. В мазках из культур, окрашенных по Граму, возбудитель представляет собой грамотрицательные палочковидные клетки (0,7 х 0,7-1,8 мкм), иног­да почти сферические. Могут быть выявлены нитевидные формы, капсулы и жгутиков нет.

Идентификация возбудителя по ферментативным свойствам. Вид T.equigenitalis является на сегодня единственным представителем рода, но при бактериологическом исследовании могут быть выделены сход­ные виды бактерий других родов, от которых возбудитель необходимо диф­ференцировать на первом этапе исследования: Wolinella recta, Bacteroides ureolyticus и Bacteroides gracilis. Перечисленные виды обитают в организме человека и в исследуемом материале могут присутствовать как контаминанты. С указанной целью определяют у выделенных культур подвижность, на­личие уреазы, оксидазы, способность к восстановлению нитрата и нитрита. Для дальнейшего изучения отбирают бактерии, не имеющие жгутиков, не образующие уреазу, обладающие оксидазной активностью, не редуцирую­щие нитраты и нитриты.

У культур контролируют отсутствие способности к росту в обычной атмосфере, наличие фосфатазы. Фосфатазную активность проверяют следу­ющим образом: в 0,5 мл трисбуфера (рН 8,0) суспензируют несколько по­дозрительных колоний, добавляют 0,5 мл раствора
р-нитрофенилфосфата (1 мг/мл), смесь выдерживают при 37° С в течение 2 часов. Положительный результат — желтое окрашивание. T.equigenitalis вырабатывает фосфатазу. В случае необходимости проверяют другие ферментативные свойства и рос­товые потребности. Для Т.equigenitalis свойственно отсутствие потребности В V-и
Х-ростовых факторах, хотя последний несколько стимулирует рост, отсутствие синтеза лецитиназы, утилизации цит­ратов, продукции индола, сероводорода, Р-галактозидазы, желатиназы, ар­гинин и лизиндекарбоксилазы, оксидации глюконата, образования кислоты из сахарозы, глюкозы, мальтозы, арабинозы, рибозы, ксилозы, эскулина, дек­строзы, дульцита, галактозы, маннозы, маннита, рамиозы, сорбита, целлобиозы, лактозы, раффинозы.

Сахаролитические свойства испытывают посевом на среды Гисса с 10% сыво­ротки крови, 1% испытуемого углевода, 0,002% бромкрезола пурпурового.

Серологическая идентификация возбудителя. При наличии гипериммунных сывороток возможна идентификация воз­будителя в реакции агглютинации или коагглютинации. РА на стекле целе­сообразно использовать на стадии отбора подозрительных колоний, при этом допускается слабая спонтанная агглютинация бактерий в контроле с физиологическим раствором. Более специфической и чувствительной счи­тается реакция коагглютинации. Антительный диагностикум готовят обыч­ным способом, используя стафилококк, содержащий А-протеин. Для отчетливой агглютинации необходимо, чтобы исследуемая бактериальная суспензия содержала как минимум 6x10^s клеток возбудите­ля. Одновременно ставят контроль на спонтанную агглютинацию. Учет результатов проводят через 5 минут.

Идентификация T.equigenitalis в ПЦР. Разработана тест-система для выявления возбудителя в исследуемом ма­териале в реакции цепной полимеризации. Учитывая сложность культиви­рования возбудителя и его выделения, особенно в случае исследования бак­терионосителей, применение ПЦР оправдано при оценке статуса живот­ных, предназначенных на экспорт.

Биопроба. Лабораторные животные к T.equigenitalis не чувствительны. В случае от­рицательного результата бактериологического исследования можно ис­пользовать биопробу на кобылах. Для ее постановки берут смегму у же­ребцов из уретральной ямки, уретры, препуция, пениса, у кобылы из клиторного синуса и ямки. Смегму разбавляют в 30 мл дистиллированной воды и ин окулируют при помощи осеменительной пипетки в матку кобы­ле. Если смегма содержит возбудитель, то через три дня его можно выде­лить из цервикальной или маточной слизи. Одновременно до заражения и после заражения (7-14-е сутки) у кобылы исследуют сыворотку крови на наличие антител в РСК и РА.