Протромбиновый тест (ПТ) по Квику

Методика выполнения ПТ-теста была предло­жена Квиком (Quick AJ. и соавт.) в 1935 г. и состо­ит в определении времени свертывания цитратнои плазмы после добавления тромбопластина и Са²⁺.

В тесте протромбиновое время по Квику для перевода времени свертывания в % факторов протромбинового комплекса строится калибровоч­ный график с использованием разведений стандарт­ной плазмы. График имеет форму логарифмичес­кой зависимости. Для вычислений вручную мож­но использовать линелизацию графика (рис. 99) в координатах «1/% протромбина» (т. е. 100% —0,01; 75% - 0,0133; 50% - 0,02; 25% - 0,04; дальнейшее разведение нежелательно, так как возможно откло­нение калибровки из-за значительного снижения концентрации фибриногена). Недостатком этого метода калибровки ПВ является то, что разведе-

ние плазмы моделирует только снижение концен­трации факторов, которое может наблюдаться, например, при нарушении синтеза белков в пече­ни или развитии коагулопатии потребления. При дефиците витамина К или приеме его антагонис­тов (непрямых антикоагулянтов) концентрация факторов может быть близкой к норме, но их фун­кциональные свойства существенно изменены. Поэтому ПВ по Квику рекомендуется использо­вать при постановке коагулограммы для выявле­ния механизмов нарушения свертывания крови.

Наклон калибровочной кривой может зави­сеть от того, какой буфер или физиологический раствор были использованы для разведений. Раз­веденная плазма нестабильна, поэтому растворы разведенной контрольной плазмы хранить не ре­комендуется, необходимо использовать столько исходной плазмы, сколько требуется для серии разведений и не больше.

При очевидной простоте выполнения самого теста оценка его результатов представляет собой серьезную проблему, которая окончательно не ре­шена до настоящего времени. Две основные при­чины обуславливают сложность проблемы. Во-первых, в тесте активируется ряд последователь­ных и взаимовлияющих реакций, и суммарная ско­рость зависит от многих параметров (рис. 100). Во-вторых, время свертывания нормальной и, что ис­ключительно важно, патологической плазмы зна­чительно варьирует в зависимости от источника и метода получения тромбопластина.

Рис. 99. Линелизация калибровочного графика протром­биновое время по Квику в координатах «1/% протромби­на» - время

Рис. 100. Последовательные и взаимовлияющие реак­ции, определяющие суммарную активность протромбино­вого теста (ПТ)

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Протромбиновое время, выраженное через международное нормализованное отношение (MHO)

Современные коагулометры программиру­ются на вычисление MHO. Стандартизованный протромбиновый тест был разработан Междуна­родным комитетом по стандартизации в гемато­логии и Международным комитетом по тромбо­зу и гемостазу и принят ВОЗ в 1983 г. В его осно­ве лежит наличие линейной зависимости между логарифмами протромбинового времени, опреде­ленными с разными тромбопластинами. На прак­тике это означает, что значения ПО, определен­ные с использованием разных тромбопластинов, могут быть приведены путем возведения в сте­пень, представляющую собой МИЧ используемо­го тромбопластина, к величине, которая была бы получена при определении факторов протромби­нового комплекса с первичным стандартом тром­бопластина. Эту величину было предложено на­зывать MHO - международным нормализованным отношением (INR - английская аббревиатура). По рекомендации ВОЗ определение МИЧ (ISI - анг­лийская аббревиатура) является обязанностью производителей тромбопластина, которые долж­ны определять относительную чувствительность каждой серии выпускаемых ими тромбопласти­нов, сравнивая ее с эталоном тромбопластина, чувствительность которого принята за единицу.

MHO рассчитывают по формуле:

Контроль за лечением непрямыми антикоагулянтами

При приеме непрямых антикоагулянтов ме­няются как внешний, так и внутренний пути ак­тивации протромбиназы, однако эффект непря­мых антикоагулянтов в большей степени сказы­вается на внешнем каскаде, и соответственно больше меняется ПВ, чем АЧТВ.

При терапии непрямыми антикоагулянтами использование MHO позволяет оценивать сте­пень гипокоагуляции независимо от используе­мого тромбопластина, сравнивать результаты, полученные разными лабораториями. Для конт-

роля за терапией непрямыми антикоагулянтами рекомендуется использовать тромбопластины со значениями МИЧ ниже 2 (лучше 1,0-1,2).

Ограничения использования MHO

Имеются достаточно значительные ограни­чения в использовании MHO в лабораторной практике:

• MHO не может использоваться на начальном
этапе лечения непрямыми антикоагулянтами,
так как существующие различия между раз­
ными тромбопластинами вносят слишком
большие флуктуации на этом этапе, которые
не могут быть компенсированы производи­
телями реагентов.

• MHO не используется для контроля и мони­
торинга состояния внешнего каскада актива­
ции протромбиназы в общей популяции па­
циентов, не принимающих непрямых антико­
агулянтов. В этом случае нужно использовать
ПТ, различия в определении которого сохра­
няются между разными лабораториями.
Комментарии по поводу разных способов

выражения ПТ-теста представлены в табл. 21.

Интерпретация результатов

ПВ удлинено (ПИ снижен, ПО и MHO повы­шены) - врожденный дефицит факторов II, V, VII, X, хронические заболевания печени с нару­шением функции, дефицит витамина К (холес-таз, мальабсорбция, дисбактериоз), лечение ан­тикоагулянтами непрямого действия, гипофиб-риногенемия (менее 0,5 г/л), дисфибриногенемия и нарушение полимеризации фибрина, ДВС-син-дром, присутствие ингибиторов свертывания (ге­парин, ПДФ).

ПВ укорочено (ПИ увеличен, ПО и MHO сни­жены) - состояние гиперкоагуляции, массивное поступление тканевого тромбопластина в крово­ток (травма, некроз), повышенная свертывае­мость во время беременности и после родов.

Выявление дефицита факторов

с использованием принципа заменных проб

в тесте ПВ

Клоттинговый метод определения активнос­ти ф.VII основан на использовании заменных

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 21

Способы выражения протромбинового теста

проб с плазмой, лишенной ф.УП. Метод анало­гичен определению активности других факторов

в тесте АЧТВ, однако при анализе активности ф.VII используется тест ПВ.

Тромбиновое время

Тромбиновое время (ТВ) - скрининговый тест на полимеризацию фибриногена/фибрина и на ан-тикоагулянтную активность в плазме. ТВ регистри­руется по свертыванию плазмы при добавлении к ней низкой или средней концентрации тромбина (бычь­его или человеческого). ТВ определяется в основном количеством и качеством фибриногена и присут­ствием антикоагулянтов в плазме. Если в плазме присутствует гепарин, то комплекс гепарин-анти­тромбин быстро нейтрализует добавленный тром­бин и ТВ будет удлиняться. Среди скрининговых тестов ТВ - наиболее чувствительный тест на при­сутствие гепарина. В то же время известно, что чув­ствительность к гепарину у ТВ зависит от рН, ион­ной силы тест-системы, свойств тромбина (проис­хождение и степень очистки), т. е. в значительной степени определяется составом набора реагентов.

Увеличение ТВ происходит также в присут­ствии относительно высокой концентрации про-

дуктов деградации фибрина (ПДФ), наблюдае­мой при назначении тромболитической терапии, при ДВС-синдроме, заболеваниях печени и при дисфибриногенемиях. Результат определяется не только общим количеством ПДФ, но и их соста­вом. Непрямые антикоагулянты не влияют на результаты теста.

Иногда удлинение ТВ наблюдается в присут­ствии аутоантител к тромбину или парапротеинов при миеломной болезни, которые препятствуют полимеризации мономеров фибрина. Ингибитора­ми полимеризации фибрин-мономеров могут быть IgG или IgM, которые удлиняют как ТВ, так и реп-тилазное время. Аутотела к тромбину подавляют только ТВ и не влияют на рептилазное время.

К увеличению ТВ приводят: • снижение концентрации фибриногена менее

0,5 г/л (врожденная или приобретенная гипо/

афибриногенемия);

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

• качественные изменения молекулы фибрино­
гена (дисфибриногенемия);

• присутствие физиологических (гепарин) и
патологических (ПДФ, моноклональные бел­
ки) ингибиторов тромбина и фибринообра-
зования;

• наличие парапротеинемии, уремии, в некото­
рых случаях волчаночных антикоагулянтов.
Пределы нормальных значений ТВ зависят от

условий постановки метода и должны определять­ся в каждой лаборатории самостоятельно. Тест не стандартизован, в разных лабораториях могут ис-

пользоваться разные концентрации тромбина. Тест может выполняться в модификациях, в част­ности после нейтрализации гепарина протамин-сульфатом. Тест практически не пригоден для мо­ниторинга за лечением гепарином или гирудином, так как результаты зависят от состояния системы фибриноген-фибрин, кроме того, ТВ характери­зуется очень малым временным интервалом. Ре­зультаты во многом зависят от того, на каком ко-агулометре проводилось исследование - механи­ческом или оптическом, но в любом исполнении характеризуются низкой воспроизводимостью.

Рептилазное время (батроксобиновое время)

Батроксобин (или рептилаза) - тромбинопо-добная протеаза из яда щитомордника обыкновен­ного, которая способна вызывать переход фибри­ногена в фибрин. Рептилаза отщепляет от фибри­ногена только фибринопептид А, что отличает ее от действия тромбина, который, кроме фибрино-пептида А, отщепляет от фибриногена еще и фиб­ринопептид В (рис. 101) и активирует факторы V, VIII, XIII. Рептилаза не подавляется антитромби­ном, поэтому этот тест может использоваться для оценки полимеризации мономеров фибрина в при­сутствии гепарина. Рептилазное время часто оп­ределяют одновременно с ТВ (табл. 22).

Таблица 22

Тромбиновое и рептилазное время при различных состояниях

Нормальные значения рептилазного времени устанавливаются в каждой лаборатории, так как показатель зависит от реагентной и приборной

базы. Рептилазное время удлиняется при афибри-ногенемии и при некоторых формах дисфибри-ногенемии, часто не параллельно ТВ и в присут­ствии относительно высоких концентраций ПДФ (при гиперфибринолизе).

Рис. 101. Принцип и влияние факторов при постановке тестов тромбиновое время (ТВ) и рептилазное время.

Тромбин оказывает комплексный эффект, рептилаза от­щепляет от фибриногена только фибринопептид А (ФПА), На ТВ активно влияет АТ-гепарин, на рептилазное время гепарин не влияет, ПДФ за счет ингибирования полимери­зации фибрин-мономеров удлиняют как ТВ, так и рептилаз­ное время

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Отдельные факторы гемостаза

В случае обнаружения патологических изме­нений АЧТВ и/или ПВ необходимо проводить дополнительные исследования с целью выясне­ния причины этих отклонений. Несмотря на то что за последнее время для определения отдель­ных факторов гемостаза были разработаны ме­тоды с использованием хромогенных субстратов (амидолитические методы), многие лаборатории продолжают пользоваться коагуляционными технологиями с использованием контрольных плазм, обедненных по определенному фактору. Дефицитные плазмы получают: 1) путем имму-носорбции отдельных факторов с добавлением других факторов, 2) от доноров, больных гемо­филией с недостаточностью одного из факторов свертывания. Важнейшими качественными кри­териями наборов с дефицитной плазмой являют­ся очень низкий или неопределяемый уровень од-

ного фактора, высокий уровень других факто­ров, наличие в наборе калибраторов с дробным содержанием фактора, чтобы можно было пост­роить калибровочную кривую как в зоне с нор­мальным, так и патологическим содержанием фактора. Для получения калибровочной кривой возможно разведение калибраторов. Ведущие мировые производители выпускают калибрато­ры, тестированные относительно стандартов ВОЗ (там, где они имеются). Следует подчерк­нуть, что далеко не любая комбинация дефицит­ной плазмы и тест-наборов на ПВ или АЧТВ дают схожие результаты, поэтому следует поль­зоваться рекомендациями фирм-производителей дефицитных плазм и тест-наборов. Качество де­фицитной плазмы и чувствительность реагентов имеют существенное значение в определении дефицита факторов в клинике.

Референтные диапазоны содержания факторов

В табл. 23 приведены референтные диапазо­ны активности факторов гемостаза в плазме и заболевания, при которых наблюдаются сниже­ние или увеличение этих факторов. Для боль­шинства факторов нормальный диапазон актив­ности составляет 70-130%, для факторов V и VIII диапазон шире. Обычно умеренное снижение факторов (ниже нормального диапазона), так же как гетерозиготное носительство дефицита фак­тора, не сопровождается кровотечениями, одна­ко при массивных оперативных вмешательствах или нарушениях функции тромбоцитов это мо­жет быть решающим моментом развития гемор­рагического синдрома. Количественная харак­теристика факторов является значимой для ди­агностики гемофилии и лечения с использовани­ем гемоконцентратов. Содержание факторов свертывания крови важно знать перед операци­ей у больных с заболеваниями печени, злокаче­ственными опухолями, сепсисом, нефротическим синдромом, у пациентов, принимающих антико­агулянты непрямого действия, так как оператив-

ное вмешательство, особенно обширное, в этих случаях может привести к дополнительному по­треблению проблемных факторов и развитию кровотечения. Технологией с использованием дефицитных плазм определяются все факторы, за исключением фибриногена и фактора XIII. Эта технология представлена в многочисленных пособиях по исследованию факторов гемостаза, поэтому в данной книге воспроизводиться не будет.

В последние несколько лет появился интерес к выявлению случаев повышения содержания от­дельных факторов гемостаза, что объясняется обнаружением хотя и относительно невысокой, но достоверной корреляции между повышенным содержанием факторов II, VII, VIII, IX, XI и уве­личенным риском тромбозов. Повышение актив­ности факторов может быть зарегистрировано коагуляционными методами с применением тех­нологии значительного разведения плазмы или методами с использованием хромогенных суб­стратов.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 23

Диапазоны активности факторов гемостаза в плазме и клинико-диагностическое значение

изменения активности факторов

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Принцип дифференцирования истинного дефицита факторов и действия ингибиторов

Удлинение АЧТВ и/или ПВ может быть выз­вано дефицитом факторов свертывания или при­сутствием ингибиторов, в частности аутоантител, волчаночного антикоагулянта и др. Для диффе­ренцирования дефицита факторов свертывания от присутствия специфического ингибитора или волчаночного антикоагулянта необходимо про­вести скрининговое исследование (количество тромбоцитов, АЧТВ, ПТ), исследование коррек­ции активности факторов или скрининговых тес­тов при смешивании тестируемой плазмы с нор­мальной, контрольной плазмой и тест разведения. Особенности проведения скрининговых тестов были описаны выше.

Исследование коррекции активности факторов свертывания проводится путем смешивания иссле-

дуемой плазмы с контрольной нормальной плаз­мой. Соотношения компонентов могут быть различными. Чаще применяется смешивание 1:1 (1 часть исследуемой плазмы / 1 часть контроль­ной), это соотношение удобно для подсчета и обла­дает неплохой чувствительностью. При низкой ак­тивности ингибитора можно использовать соотно­шение: 2 части исследуемой плазмы / 1 часть конт­рольной. При высокой активности можно исполь­зовать соотношение 1:4 и более и по степени коррек­ции косвенно судить об активности ингибитора.

После смешивания необходимо проводить те­сты немедленно и через 1 час инкубации, что по­зволяет определить характер ингибитора (табл. 24).

Для более точной дифференциальной диагно­стики между истинным и вторичным дефицитом

Дифференциальная диагностика врожденного дефицита факторов VIII и IX, специфического ингибитора и волчаночного антикоагулянта

Таблица 24

можно провести пробу с разведением, по край­ней мере, до 3 разных концентраций. Пробы с дефицитом показывают при разведении одинако­вый расчетный процент фактора в цельной плаз­ме. Пробы, в которых присутствует ингибитор, при разведении показывают относительное уве­личение фактора, что связано с диссоциацией

Рис. 102. Метод разведения пробы позволяет разли­чить истинный дефицит фактора и его ингибирование.

При истинном дефиците разведение не меняет относитель­ной активности фактора, а при подавлении активности фактора ингибитором разведение сопровождается отно­сительным повышением активности фактора

комплекса фактор-ингибитор и освобождением фактора из блокированного состояния (рис. 102).

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Date: 2015-05-19; view: 712; Нарушение авторских прав