Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Метод выделения и культивирования хламидийВыделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала. Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл, стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл. Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37°С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня. При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% суспензии желточных мешков. Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды. Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей. Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторакального заражения морских свинок. Наиболее приемлемым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов). Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах. Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии. Для культивирования хламидий используют первичные и перевиваемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят материалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4°С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли: 1) контроль монослоя в норме; 2) контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом; 3) контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий. Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).
|