Природа и многообразие биотехнологических процессов

Вероятно, древнейшим биотехнологическим процессом было сбраживание с помощью микроорганизмов. В 1981 году при раскопках Вавилона бала обнаружена глиняная дощечка, датируемая примерно 6-м тысячелетием до нашей эры. На ней был записан рецепт изготовления пива. Совершенствование процессов сбраживания, увеличение их эффективности шли параллельно с развитием методов выделения из клеток грибов и микроорганизмов различных веществ, таких как антибиотики и противопаразитарные препараты.. биотехнологические процессоы основаны на методах генной инженерии. Основу генной инженерии составляют эксперименты с рекомбинантными молекулами ДНК. Согласно определению Национального института здоровья США, рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке. Основу эксперимента составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой плазмиду или геном вируса. Затем рекомбинантную молекулу ДНК вводят, как правило, в бактериальную клетку, где она реплицируется. Этот процесс называется трансформацией. Клетка, содержащая такую рекомбинантную молекулу, размножается, образуя клон трансформированных клеток, способных продуцировать специфические, чужеродные для бактерий, белки в больших количествах.

4. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), присутствующая в каждом организме и в каждой живой клетке, главным образом в её ядре, нуклеиновая кислота, содержащая в качестве сахара дезоксирибозу, а в качестве азотистых оснований А, Г, Ц и Т. Играет очень важную биологическую роль, сохраняя и передавая по наследству генетическую информацию о строении, развитии и индивидуальных признаках любого живого организма. ДНК - биополимер, состоящий из многих мономеров - дезоксирибонуклеотидов, соединённых через остатки фосфорной кислоты в определённой последовательности, специфичной для каждой индивидуальной ДНК. Уникальная последовательность дезоксирибонуклеотидов в данной молекуле ДНК представляет собой кодовую запись биологической информации. Две такие полинуклеотидные цепочки образуют в молекуле ДНК двойную спираль, в которой комплементарные основания – А с Т и Г с Ц - связаны друг с другом при помощи водородных связей и так называемых гидрофобных взаимодействий. Такая характерная структура обусловливает не только биологические свойства ДНК, но и её физико-химические особенности. Большое число фосфатных остатков делает ДНК сильной многоосновной кислотой (полианионом), наличие пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает интенсивное поглощение ультрафиолетовых. Стр: молекулы ДНК имеют кольцевую (иногда однонитевую) или, реже, линейную структуру. В клеточном ядре ДНК находится преимущественно в виде хромосом и хроматина. В ядре каждой соматическую клетки (диплоидной клетки тела) содержится постоянное количество ДНК; в ядрах половых клеток (гаплоидных) оно вдвое ниже.

5. Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма. Самым ярким событием была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, путём проникновения в её генетический аппарат. Учёные научились модифицировать гены или создавать совершенно новые, комбинируя гены различных организмов, синтезировать гены, причём точно по заданным схемам, вводить такие искусственные гены в живые организмы и заставили их там работать. Это было начало генетической инженерии. Основа — бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых — способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение — аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Цель этих приёмов одна — добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат — получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Но получить и выращивать культуры клеток труднее, чем бактериальные культуры. М-ды: 1) Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз). 2) Прямой химический синтез ДНК. 3) Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

6.Рекомбинация - процесс обмена генетическим материалом путем разрыва и соединения разных молекул нуклеиновых кислот - перераспределение генетического материала, приводящее к созданию новых комбинаций генов. В естественных условиях рекомбинация у эукариот – обмен участками хромосом в процессе клеточного деления. Методы генной инженерии значительно расширили возможности рекомбинационных обменов и позволяют, в отличие от естественной рекомбинации, получать гибридные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие как угодно далеко чужеродные фрагменты. Суть этой технологии заключается в соединении фрагментов ДНК in vitro(в пробирке) с последующим введением рекомбинантных генетических структур в живую клетку. Генно-инженерные манипуляции стали возможны после открытия рестриктаз (ферментов, разрезающих ДНК строго в определенных участках) и лигаз (ферментов, сшивающих двухцепочечные фрагменты ДНК). Рестриктазы могут образовывать фрагменты, как с «тупыми», так и с «липкими» концами. С помощью этих ферментов получают определенные фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Мет-ка: 1) выделение нужного (целевого) гена; 2) встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор); 3) введение вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены. Белки, полученные генно-инженерным способом, то есть транслируемые с рекомбинантных ДНК, также называются рекомбинантными. С помощью технологии создания рекомбинантных структур были открыты и изучены: мозаичное строение генов у высших организмов, транспозоны бактерий и мобильные диспергированные элементы высших организмов, онкогены и т.д. Рекомбинантные структуры нашли широкое применение в промышленной биотехнологии, включая производство ферментов, гормонов, интерферонов, антибиотиков, витаминов и многих других продуктов для фармакологии и пищевой промышленности, на получение которых ранее затрачивалось много времени и средств. Методом рекомбинантных ДНК были получены генетически модифицированные растения и трансгенные животные, обладающие новыми полезными для человека свойствами. Рекомбинантные структуры используются в медицине в методах генной терапии, диагностики и создании рекомбинантных вакцин.

7. Конструирование ДНК.Ферменты. Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК. Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу. Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате са-мокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие ре-стриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс лигирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С). Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен поли-А-хвост, на другом — поли-Т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15—20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

8. Биотехнология рекомб.ДНК. Под рекомбинантными ДНК понимают образованные объединением in vitro (вне организма) (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Определенные фрагменты ДНК, в т.ч. и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты, как с «тупыми», так и с «липкими» концами. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. Технология рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. Часто эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме: -из организма - донора нужных генов экстрагируют нашивную (чужеродную, клонируемую) ДНК; подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования) с образованием новой рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК»);-эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией;

-идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);

-получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками - хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

9. Перенос ДНК. Созд.векторов. Векторами называются молекулы ДНК, способные встраивать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию и трансформацию (перенос в другие организмы). Таким образом, вектор позволяет осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды, мобильные элементы По профилю использования их можно разделить на несколько типов.

Векторы для клонирования используют для увеличения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор, посредством репликации (плазмиды и фаги).

2.Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательных генов и их белковых продуктов, а также наработки конкретного белка.

3.Векторы для трансформации. Используют для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.

Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, биохимически нйтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к последним.

10. Получение гена для встраивания в вектор. Получение нужного гена - один из наиболее трудных этапов в работе генных инженеров. Для этого используют следующие методы:

• метод «дробовика», основанный на разрезании ДНК специальными ферментами (рестриктазами) и поиск фрагмента, содержащего нужный ген;

• получение копии гена на иРНК с помощью фермента обратной транскриптазы;

• искусственный синтез гена.

Метод «дробовика», или использование рестрикционных ферментов. Мощный инструмент генной инженерии - ферменты рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Метод дробовика — метод, используемый для секвенирования длинных участков ДНК. Суть метода состоит в получении случайной массированной выборки клонированных фрагментов ДНК данного организма, на основе которых может быть составлена его геномная библиотека.

Метод обратной транскрипции. Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестрикцонных ферментов. Для получения нужного гена из клеток донора сначала выделяют иРНК, являющуюся его транскрипционной копией. Способ такого выделения хорошо разработан. Обратная транскрипция осуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой, который называют еще обратной транскриптазой или ревертазой. Этот фермент использует выделенную иРНК как матрицу для синтеза комплиментарной нити ДНК. В результате образуется двунитевая РНК-ДНК-молекула. Затем иРНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза ДНК-полимеразой клетки комплиментарной второй цепи ДНК.

Химический синтез генов. Последовательность нуклеотидов в гене можно определить непосредственно исходя из аминокислот белка, кодируемого этим геном. Затем синтезируют ген из дезоксирибонуклеотидов, соединяя их друг с другом в определенном порядке. Первый синтетический ген получил знаменитый индийский ученый Г. Корана. когда только зарождались современные способы химического синтеза генов. Автоматические синтезаторы олигонуклеотидов еще не существовали. В те годы лаборатория Г. Кораны была настоящим международным центром синтетической химии нуклеиновых кислот. Одно из основных достижений Г. Кораны - создание блочного способа синтеза длинных полинуклеотидных последовательностей. Для этого сначала синтезировали отдельные блоки, которые потом «сшивали» ДНК-лигазой. На концах синтетического гена обычно оставляют «липкие» концы для встраивания его в вектор, разрезанный рестриктазами. Таким образом, например, был синтезирован ген гормона соматостатина. Это белковый гормон, состоящий всего из 14 аминокислот и известный как ингибитор роста.

11. Встраивание гена в вектор. Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы:

1. Биотрансформация. Используются векторы, способные сами проникать в клетки. Частным случаем биотрансформации является агробактериальная трансформация.

2. Микроинъекции. Используются, если клетки, подлежащие трансформации, достаточно крупные (например, икринки, пыльцевые трубки).

3. Биобаллистика (биолистика). Векторы «вбивают» в клетки с помощью специальных «пушек».

В качестве векторов часто используют плазмиды (кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток), а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы – участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными.

Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности, отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними определенные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, то есть должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки–хозяина.

12. Конструирование молекулы ДНК. Один из важных этапов конструирования это легирование(сшивание) генов с помощью ферментов лигазы, 2 вида сшивания 1. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод) Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном. Некоторые рестриктазы, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы,, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов. Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликацииСшивка по "тупым" концам (коннекторный метод) Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

13. Микрообрагнизмы и пр-во полезных в-в. Биотехнология использует микроорганизмы и вирусы, которые в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают естественным путем необходимые нам вещества - витамины, ферменты, аминокислоты, органические кислоты, спирты, антибиотики и др. биологически активные соединения. В настоящее время микроорганизмы используются, в основном, в трех видах биотехнологических процессов:1) для производства биомассы; 2) для получения продуктов метаболизма (например, этанола, антибиотиков, органических кислот и др.); 3) для переработки органических и неорганических соединений как природного, так и антропогенного происхождения.В промышленном масштабе биотехнология представляет индустрию, в которой можно выделить следующие отрасли: производство полимеров и сырья для текстильной промышленности; получение метанола, этанола, биогаза, водорода и использование их в энергетике и химической промышленности; производство белка, аминокислот, витаминов, ферментов и т.д. путем крупномасштабного выращивания дрожжей, водорослей, бактерий; увеличение продуктивности сельскохозяйственных растений и животных; получение гербицидов и биоинсектицидов; широкое внедрение методов генной инженерии при получении новых пород животных, сортов растений и выращивания тканевых клеточных культур растительного и животного происхождения; переработка производственных и хозяйственных отходов, сточных вод, изготовление компостов с применением микроорганизмов; утилизация вредных выбросов нефти, химикатов, загрязняющих почву и воду; производство лечебно-профилактических и диагностических препаратов (вакцин, сывороток, антигенов, аллергенов, интерферонов, антибиотиков и др.)

14. Совр.микроорг. пр-во. Микробиологическое производство условно делят на 3 типа: 1)основанное на использовании биомассы живых организмов. Сюда относят производство кормовых дрожжей, вакцин, белково-витаминных концентратов, заквасок для получения кисломолочных продуктов, удобрений; 2)продукты микробного биосинтеза: антибиотики, гормоны, ферменты, аминокислоты, алколоиды, витамины, заменители крови;

3)на получение продуктов брожения. Процесс гниения, утилизация отходов с целью получения углеводов, биогаза, спиртов, орг. Кислот, растворителей, и утилизация неприродных соединений- ксенобиотиков.

15. Особ.-ти микробиол.проц. Особенности: 1)процессы микробиологического синтеза являются частью многокомпонентного производства; 2)при культивировании микроорганизмов необходимо поддерживать асептические условия, провести стерилизацию аппаратов, материалов, сырья; 3)культивирование осуществляется в гетерогенных многофазных системах; 4)технологический процесс характеризуется высокой вариабельностью из за наличия в системе био обьекта (популяций микроорганизмов); 5)сложность биохим механизмов в регуляции роста и биосинтеза продукта метаболизма; 6)сложность хим состава ферментных сред; 7)влияние промежуточных и биомассы на скорость протекающего процесса; 8)низкие концентрации субстратов,продуктов и скорости реакции; 9) способность к саморегуляции;10) условия, оптимальные для роста микроорганизмов, биосинтеза солевых продуктов и их метаболизма.