Препаратов

Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из
диагностического материала (метод прямой микроскопии), наиболее
часто используется метод Ziehl-Neelsen. Однако при большом
количестве исследуемых ежедневно мазков в целях ускорения
процедуры микроскопии практикуется использование

люминесцентной микроскопии.

10.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl-Neelsen

Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее употребляемым и распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

- окраска фуксином (с подогреванием) — при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия

карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;

- обесцвечивание (3 мин.) — последующая обработка мазка 25%
раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта
приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не
обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к
разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и
спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и
остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный
цвет;

- контрастирующая окраска (1 мин.) — обесцвеченные элементы
мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности
препарату.

10.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl-Neelsen

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

— растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями
глицерина, добавить по каплям 10 мл 96° этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):

— расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого
подогревания на водяной бане (температура плавления фенола — 41°С).
Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100
мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

— в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл
насыщенного раствора фуксина (1).

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.

Никогда не добавляйте воду в кислоту. б) Раствор солянокислого спирта

Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3% солянокислый спирт:

Этиловый спирт 96° 97 мл

Концентрированная соляная кислота 3 мл

К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

— растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл
дистиллированной воды.

Хранение растворов. Все приготовленные растворы должны быть профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре, в темном месте.

Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более 2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в осадок, что изменяет заданные свойства раствора.

Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении. Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть уверенным в качестве используемых красителей.

Процедура окраски:

— убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и
промаркированы;

— препараты помещают на подставку («рельсы») так, чтобы они
не касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка
1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону.
Максимально на стандартные «рельсы» помещают не более 12 стекол;

— на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги
так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того,
чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет
использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на
мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом
исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые
микобактерии;

— наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и
нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления
паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не
закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок
оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку
микобактерии и окрасил ее;

— пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;

— осторожно смывают остатки краски слабой струей
дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое
отхождение краски. При промывании мазков используют холодную
воду или воду комнатной температуры.

— перед тем, как нанести на стекло следующий раствор, щипцами
или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и
наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление
следующего реактива;

— мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих
растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;

— мазок тщательно промывают дистиллированной водой и
докрашивают в течение 1 минуты, не превышая экспозицию, 0,3%
раствором метиленового синего;

— вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое
стекло, чтобы стекала вода;

— высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре
в вертикальном или наклонном положении.

Не следует промокать препарат.

В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы — в голубой.

При использовании 0,3% раствора метиленового синего для окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот краситель может как бы «скрыть» кислотоустойчивые микобактерии.

Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным солянокислым спиртом.

Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.

Date: 2015-09-17; view: 476; Нарушение авторских прав