МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Методические указания Лабораторная диагностика туляремии подготовлены д.б.н

Методические указания "Лабораторная диагностика туляремии" подготовлены д.б.н. Мещеряковой И.С. (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается, главным образом, на иммунологических методах (серо-аллергическая диагностика) и в меньшей степени на бактериологических методах. В методические указания включены методы лабораторной диагностики, позволяющие быстро и надежно выявлять это заболевание у человека и обеспеченные диагностическими препаратами, а также некоторые перспективные методы и приемы, находящиеся на стадии внедрения в практику.

1. Аллергические методы

В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление которой может служить методом аллергической диагностики туляремии. Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрата на введение туляремийного антигена (тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция становится положительной обычно с 3 - 5-х суток болезни, реже - в более поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10 - 15 дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных сохраняется 5 - 6 лет, иногда дольше, и может служить методом определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и внутрикожно с соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция на введение антигена - это общая реакция организма, которая при развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в качестве диагностического приема у больных людей проба с тулярином должна применяться с осторожностью.

1.1. Внутрикожная проба с тулярином. Для внутрикожной пробы применяют внутрикожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 °С в течение 1 часа. Взвесь готовят на физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл препарата (или 10 человеко-доз). Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.

Техника постановки реакции. Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем строго внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети). Кожу предварительно обрабатывают спиртом и эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3 - 4 мм, который примерно через 30 минут рассасывается.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24 - 48 часов путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6 - 10 час обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24 часа реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде гиперемии без инфильтрата, исчезающие через 48 часов, расценивают как отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях возможна повторная постановка реакции, так как отрицательный результат мог быть обусловлен ранним сроком от начала заболевания. Так, аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции. Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических узлов и повышением температуры тела на 1 - 1,5 °С в течение 1 - 2 дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.

1.2. Накожная проба с тулярином. Для накожной пробы применяют накожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 °С в течение 1 часа. Взвесь готовят в физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для определения иммунитета у привитых против туляремии или для анамнестического обследования.

Техника постановки реакции. Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой наносят на обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным скарификатором делают две параллельные насечки длиной 8 - 10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно после вскрытия ампулы.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48 - 72 часа. Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и краснотой, которые иногда появляются уже через 24 часа после введения тулярина, через 48 - 72 часа реакция ярко выражена и далее постепенно угасает, полностью исчезая к 7 - 10 дню. Диаметр реагирующего участка достигает 1 - 2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются везикулы, исчезающие через 2 - 3 дня. Реакцию считают положительной при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При правильной технике постановки накожная туляриновая проба по чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней не сопровождается повышенными местными или общими реакциями. Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или подкожно, так как он может вызвать бурную местную и общую реакции.

1.3. Реакция лейкоцитолиза (РЛ). Аллергические методы диагностики in vivo (накожная и внутрикожная туляриновые пробы) просты в исполнении и до настоящего времени используются на практике. Вместе с тем, введение даже убитого антигенного препарата небезразлично для организма обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления и оценки гиперчувствительности методом in vitro с помощью альтерации лейкоцитов - реакции лейкоцитолиза (Суханов с соавторами). РЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена (антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации или заболевания (3 - 4 день), удерживается в течение многих лет (у переболевших - до 40 лет). На 7 - 15 день после вакцинации показатели лизиса лейкоцитов составляют в среднем 49 - 50%, затем постепенно снижаются, но даже через 1 - 5 лет после вакцинации оставались на достаточно высоком уровне (30 - 31%). РЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько часов после взятия крови, осуществляется in vitro, т.е. без введения в организм специфического аллергена.

Техника постановки РЛ. В 2 лунки полистироловой пластины вносят по 50

мкл 10% раствора цитрата натрия, затем в первую (опытную) лунку добавляют

50 мкл антигена (накожного тулярина, содержащего 1 х 10 бактерий в 1 мл),

а во вторую (контрольную) - 50 мкл физиологического раствора. Таким

образом, в обеих лунках конечная концентрация цитрата натрия составляет 5%.

Кровь для исследования берут из пальца руки и в количестве 100 мкл вносят в

каждую из двух лунок. Пластинку закрывают и помещают на 2 часа в термостат

при температуре 37 °С. Кровь в лунках тщательно перемешивают

стеклянной палочкой. Затем по 20 мкл крови из обеих лунок поочередно

забирают с помощью микропипеточного дозатора и переносят в соответствующие

лунки планшета для макроагглютинации, содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной

кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета с помощью метиленовой

синьки.

Учет и оценка РЛ. Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из обеих лунок в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:

М х М

к 0

К% = ------- х 100,

М

к

где:

М - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);

М - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).

к

Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей:

К = 15% - отрицательный или сомнительный результат;

К = 16 - 20% - слабо положительный результат;

К = 21 - 30% - положительный результат;

К = 31% и выше - резко положительный результат.

2. Серологические методы

2.1. Реакция агглютинации. Наиболее распространенным и вместе с тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии является реакция агглютинации (РА). Реакция служит для установления диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть использована при изучении иммунологического состояния привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно отмечается через 10 - 15 дней, при этом агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50 - 1:100, но далее быстро нарастает и на 4 - 6 неделе болезни достигает 1:400 - 1:800, реже 1:1600 и выше. По достижении максимальных показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и через 6 - 12 месяцев составляет 1:100 - 1:400, позднее падает до 1:10 - 1:50 и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность сохранения агглютининов делает возможным использование РА для ретроспективного диагноза. У привитых против туляремии агглютинины обнаруживаются через 2 - 3 недели, достигают через 4 - 6 недель максимальных титров 1:160 - 1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10 - 1:40 и обычно выявляются в течение 5 - 7 лет после вакцинации (иногда дольше).

Кровь для исследования у больного (или вакцинированного) берут из локтевой вены в количестве 3 - 5 мл (для макроагглютинации) или из пальца руки (для микроагглютинации). Реакцию ставят с сывороткой, которая должна быть прозрачной.

2.1.1. Реакция макроагглютинации (РА). Антигеном для постановки РА служит туляремийный диагностикум, представляющий собой убитую формалином взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл препарата содержится 25 млрд. туляремийных бактерий. Для постановки РА туляремийный диагностикум предварительно разводят физиологическим раствором (рН = 7,0 - 7,2) в 5 раз до концентрации 5 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл.

Техника постановки РА. В каждую пробирку разливают по 0,5 мл сыворотки, разведенной физиологическим раствором рН 7,0 - 7,2, до 1:12,5; 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400. Во все пробирки доливают по 0,5 мл взвеси диагностикума в концентрации 5 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл. Таким образом, получают соответствующий ряд фактических разведений сыворотки: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800 с содержанием в каждой пробирке по 2,5 млрд. туляремийных бактерий. В контрольной пробирке содержится 0,5 мл антигена и 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Для контроля сыворотки используют исходное разведение в объеме 1 мл без добавления антигена. После добавления антигена в опытные пробирки штатив встряхивают и помещают в термостат (37 °С) на 2 часа. Реакцию оставляют затем при комнатной температуре до следующего дня.

Учет и оценка РА. Учет результатов РА производят через 18 - 24 часа невооруженным глазом. Оценку реакции осуществляют на основании степени прозрачности надосадочной жидкости в пробирках, количества и характера осадка микробной массы (агглютината):

1) резко положительная реакция - полное просветление жидкости с осадком микробов в виде "зонтика"; при встряхивании пробирки осадок разбивается на крупные хлопья; обозначается 4-мя плюсами (++++);

2) положительная реакция - значительное просветление жидкости с осадком, который при легком встряхивании поднимается со дна хлопьями; обозначается 3-мя плюсами (+++);

3) слабо положительная реакция - видимая невооруженным глазом агглютинация с незначительным осадком; обозначается 2-мя плюсами (++);

4) сомнительная реакция - видимая невооруженным глазом агглютинация без образования осадка; обозначается одним плюсом (+);

5) отрицательная реакция - отсутствие агглютинации и просветления жидкости; обозначается минусом (-).

Агглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). При учете результатов реакции следует иметь в виду возможность задержки агглютинации (проагглютинационная зона) в небольших разведениях сыворотки.

При серологической диагностике туляремии у человека диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако обязательно должно быть прослежено его нарастание. При отрицательной или сомнительной реакции, а также при положительной реакции в низких разведениях сыворотки у подозрительных на туляремию больных рекомендуют повторить исследование сыворотки через 7 - 10 дней. Нарастание титра сыворотки в 2 - 4 и выше раза свидетельствует о свежем случае туляремии и подтверждении диагноза.

2.1.2. Реакция микроагглютинации (РМА). Реакцию агглютинации можно

ставить в микрообъемах, используя для этого сыворотку или плазму крови,

взятую из пальца руки. Диагностикум для реакции микроагглютинации готовят

из убитой культуры вакцинного штамма туляремийного микроба, которую

окрашивают гематоксилином (модификация Брикмана и Мериновой). Для этого

взвесь культуры в концентрации 1 х 10 м.кл./мл смешивают в равных объемах

с 1%-ным раствором формалина. После 2-часовой экспозиции клетки дважды

отмывают от формалина физиологическим раствором. Осадок разводят до

концентрации 5 х 10 м.кл./мл и смешивают с равным объемом гематоксилина,

приготовленного по методу Караччи: 0,1 г гематоксилина растворяют в 100 мл

дистиллированной воды, добавляют 25 мл глицерина, 5,0 г калийных квасцов и

2 - 3 кристалла йодноватистого калия; раствор имеет вишневую окраску.

Окрашивание производят в водяной бане в течение 20 - 24 часов при 56 °С и

периодическом встряхивании культуры. Затем бактерии 3 - 4 раза отмывают

физиологическим раствором, центрифугируют при 6000 об./мин. в течение 30

мин. до получения бесцветной и прозрачной надосадочной жидкости. Осадок

окрашенных бактерий разводят физиологическим раствором до оптимальной

концентрации (обычно 2 - 5 х 10 м.кл./мл). Для определения оптимальной

концентрации диагностикума несколько его разведений испытывают в реакции

микроагглютинации с диагностической туляремийной сывороткой. Диагностикум

сохраняют при температуре 4 °С, предварительно добавив в него формалин до

конечной концентрации 0,1%. Срок сохранения активности диагностикума не

менее 2-х лет.

Техника постановки и учет РМА. Реакцию микроагглютинации ставят в полистироловых пластинах микротитратора Такачи. Для этого в ряд лунок полистироловой пластины микротитратора Такачи вносят 50 мкл физиологического раствора (рН = 7,0 - 7,2). Затем с помощью титратора с головкой объемом 50 мкл раститровывают исследуемую сыворотку, предварительно разведенную 1:5 (или неразведенную плазму крови), и добавляют в каждую лунку равный объем (50 мкл) цветного, окрашенного гематоксилином диагностикума. При этом происходит разведение сыворотки в 4 раза (с 1:5 до 1:20), и получают следующий ряд разведений сыворотки: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. Пластины тщательно встряхивают и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 °С, затем выдерживают 12 - 18 часов при комнатной температуре. В лунках с положительным результатом антиген выпадает на дно в виде "зонтика" (агглютинат), а в случае отрицательного результата - в виде "пуговки". Титры реакции микроагглютинации, как правило, совпадают или на одно разведение ниже титров РА, выполненной макрометодом.

2.2. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунологического состояния привитых. У больных туляремией антитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1 - 1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:10000 - 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100 - 1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако в более низких титрах, не превышающих 1:2000 - 1:5000 через 1 - 1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20 - 1:80.

Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ной концентрации.

Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 °С в течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6 лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок). После разлива разводящей жидкости в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2 - 3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.

Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме: 1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде "зонтика", у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев; 2) положительная реакция (+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки; 3) слабо положительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки; 4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината; 5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде "пуговки" или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако так же, как и в случае РА, необходимо проследить за его нарастанием.

РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки-капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1 - 1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.

Учет реакции производят по следующей схеме: 1) "+" - полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде "зонтика", занимающего не менее 2/3 дна; 2) "+/-" - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера; 3) "-" - отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой "пуговки" или колечка с ровным краем.

Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции - реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум. РТПГА обычно ставят в ряду из 7 - 8 лунок. Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титрование. Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2 - 3 часа.

Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2 - 4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.

Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА так же, как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7 - 8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забирают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремийного антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.

2.3. Иммуноферментный анализ на твердом носителе (ИФА). Метод используют для диагностики туляремии у больных и переболевших людей, определения иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией специфические антитела обнаруживаются в ИФА между 6 - 10 днями, достигают максимальных показателей к 4 - 7 неделям, затем уровень их снижается, но они продолжают длительно (более 10 лет) выявляться после переболевания. ИФА обеспечивает более раннюю (в сравнении с РА и РПГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител у больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от 1:400 до 1:40000 и выше и, как правило, в 10 - 20 раз превышают таковые в РА и РПГА.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему иммуноферментную для определения туляремийных антител. Выявление туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет специфического взаимодействия антигена туляремийного микроба, адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой сыворотке. Образовавшийся комплекс "антиген - антитело" определяют с помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой.

В соответствии с назначением тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липополисахарид; антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой; контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов; субстрат - О-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.

Техника постановки ИФА.

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора туляремийного антигена в концентрации 10 мкг/мл в 0,02 М растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2. Адсорбцию туляремийного антигена на планшетах проводят в течение 120 мин. при температуре 37 °С или 18 часов при температуре 20 °С. Затем антиген удаляют встряхиванием планшетов с последующей трехкратной отмывкой (по 5 мин.) раствором ФСБ (рН 7,2), содержащим 0,05% детергента - твин-20.

2. Внесение исследуемого материала. Исследуемые сыворотки, разведенные 1:200 и далее последовательно путем двукратных разведений на ФСБ-твин, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми сыворотками (на каждом планшете) вносят аналогичным образом разведенные заведомо отрицательную и положительную туляремийную сыворотку человека. Планшеты выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 часа. После чего жидкость удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (указанном на этикетке); конъюгат разводят на ФСБ-твин, содержащем 1% БСА. Планшеты выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 часа. Жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

4. Проявление. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора,

содержащего 0,04% О-фенилендиамина и 0,04% H O в 0,1 М цитратно-фосфатном

2 2

буфере рН 5,5. Инкубацию проводят в темноте при комнатной температуре 15 -

30 мин. и останавливают внесением в лунки по 100 мкл серной кислоты в

концентрации 0,5 мол/л.

5. Учет и оценка результатов ИФА. Результаты реакции можно учитывать визуально, сравнивая окраску в опытных лунках с контрольными, или определять интенсивность окрашивания субстратной смеси инструментально, используя микроэлектрофотометр типа Multiskan, при длине волны 492 нм. Появление желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов проба считается положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раза превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей.

Пробы рекомендуется первоначально исследовать параллельно в 2 лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных сывороток для определения титра антител, используя 2-кратные разведения сывороток.

При постановке ИФА предусматриваются следующие контроли (на каждом планшете): 1) отрицательная сыворотка в разведении 1:200 и выше - отсутствие окрашивания раствора; 2) положительная сыворотка в разведении 1:200 и выше - выраженное окрашивание раствора (при инструментальной оценке ОП не менее чем в 2 раза выше ОП отрицательной сыворотки); 3) контроль конъюгата (вместо сыворотки вносят раствор ФСБ-твин) - отсутствие окрашивания раствора; 4) контроль субстратной смеси (вместо конъюгата вносят раствор ФСБ-твин) - отсутствие окрашивания раствора. В сомнительных случаях для подтверждения специфичности результатов рекомендуется постановка реакции торможения специфическим антигеном. Диагностическим титром в ИФА считают разведение сыворотки 1:400 и выше. Более подробно методика ИФА отражена в Инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для определения туляремийных антител (1986 год).

В последние годы для диагностики туляремии разработаны и некоторые другие методы, в частности, основанные на использовании синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

2.4. Применение непрямого иммунофлуоресцентного метода для обнаружения туляремийных антител. При применении непрямого ИФМ для обнаружения антител к туляремийному микробу заранее готовят мазки из 1 - 2 суточной агаровой культуры возбудителя (1 млрд. взвесь). При этом на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин., не обжигая, высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят 2-кратно с разведением 1:10 до 1:640 - 1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат (37 °С на 30 мин.). Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется, как при прямом иммунолюминесцентном методе. После просмотра препарата под люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.

В качестве контролей служат препараты, в которых туляремийные бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии (отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с подозрением на туляремию диагностическим считается титр не менее 1:40.

3. Бактериологические методы

Бактериологические методы диагностики туляремии имеют дополнительное значение и не всегда эффективны, что определяется особенностями течения инфекции у человека с малой обсемененностью органов и тканей возбудителем. Следует учитывать, что не в любом материале, взятом от больного, содержатся живые туляремийные бактерии. Кроме того, выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2 - 3-х недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки.

Выделение и идентификация возбудителя туляремии могут быть произведены только в специально оборудованных режимных лабораториях. Забор и доставку патологического материала в лабораторию производят с соблюдением предосторожностей и правил работы с особо опасными инфекциями II группы патогенности.

3.1. Посев на питательные среды. Использование бактериологического метода при диагностике туляремии возможно, но по сравнению с биологическим методом малоэффективно, так как в организме больного туляремийные бактерии содержатся в малом количестве. Лишь в редких случаях удавалось высевать возбудитель туляремии из патологического материала от больных людей (содержимое язвы на коже, содержимое бубона и т.д.). Патологический материал от больных может быть исследован методом посева лишь в первые 2 - 3 недели от начала заболевания. Для этого используют специальные среды, применяемые для культивирования туляремийного микроба. Наиболее чувствительными и доступными являются свернутая желточная среда, желточно-агаровая среда, различные варианты агаровых сред, содержащих цистин, глюкозу, кровь, другие факторы роста, а также специальные среды для культивирования туляремийного микроба (подробно см. Приложение 2). Скорость появления роста культуры зависит от количества микробов в исследуемом материале: при посеве слабо инфицированного материала рост отдельных колоний возможен в отдаленные сроки, поэтому посевы следует выдерживать в термостате при 37 °С в течение не менее 10 суток.

3.2. Биологическая проба. Биологическая проба является самым чувствительным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале, в том числе и при исследовании материала от больных людей, т.к. биопробные животные (белые мыши, морские свинки) заболевают туляремией со смертельным исходом при подкожном введении единичных бактерий. Однако при обследовании больных людей даже биологический метод не всегда надежен, так как не в любом образце материала, взятом от больного, имеются жизнеспособные туляремийные бактерии. В отделяемом кожной язвы и в пунктате из пораженного лимфатического узла возбудитель туляремии может быть обнаружен в течение 3 недель от начала заболевания, редко позднее. Известны случаи выделения возбудителя из мокроты, материала, взятого из зева (с миндалин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях удается выделить возбудитель из крови, но обычно не позднее первой декады болезни.

Патологический материал (отделяемое кожной язвы, конъюнктивы глаза, миндалин или мокроту, пунктат из бубона) смешивают с небольшим количеством физиологического раствора (0,3 - 0,5 мл) и вводят подкожно белой мыши или внутрибрюшинно морской свинке. Кровь для исследования (3 - 5 мл) берут из локтевой вены, разводят пополам физиологическим раствором и вводят подкожно белым мышам (по 0,5 - 1,0 мл) или внутрибрюшинно морским свинкам (5 - 7 мл). Сроки гибели биопробных животных зависят от степени инфицированности патологического материала и составляют 4 - 9 и более суток (до 15) для белых мышей и 6 - 15 (до 20) для морских свинок. Культуру туляремийных бактерий от биопробных животных выделяют посевом на специальные питательные среды (см. выше). Идентификацию свежевыделенной туляремийной культуры осуществляют на основании совокупности следующих признаков: 1) морфологии клеток и грамотрицательной их окраски в мазках; 2) характера роста на желточной среде или специальных средах; 3) отсутствие роста на простых мясопептонных средах; 4) агглютинация туляремийной сывороткой; 5) специфическим свечением в реакции иммунофлуоресценции; 6) способностью вызывать гибель белых мышей и морских свинок при их заражении испытуемой культурой с характерными для туляремии патологоанатомическими изменениями в органах и выделением чистой культуры возбудителя.

3.3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), прямой метод. При исследовании патологического материала от больных может быть эффективен прямой иммунофлуоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Имеются данные, когда методом РИФ у больного туляремией через 2 месяца от начала заболевания в мазках-отпечатках из бубона были обнаружены туляремийные бактерии, тогда как выделение возбудителя бактериологическими (биологическими) методами оказалось безуспешным. В качестве объектов, подвергающихся исследованию в РИФ, могут быть мазки, приготовленные из патологического материала больного: содержимого кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемого слизистой глаза, смывы с зева, миндалин и др.

Техника приготовления препарата. Каплю исследуемого материала наносят на тщательно обезжиренное стекло и делают тонкий мазок. Препараты подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в 96° этиловом спирте в течение 15 - 20 мин. Фиксированные препараты подсушивают на воздухе. До обработки препаратов люминесцирующей сывороткой их хранят при 4 °С.

Техника постановки реакции. Для постановки РИФ (прямой метод) используют сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку, которая представляет собой высушенную лиофильно иммуноглобулиновую фракцию сыворотки с присоединенным к ней химическим путем флуоресцирующим красителем - изотиоцианатом флуоресцеина.

При исследовании в РИФ тканевого материала в целях повышения специфичности результатов анализа и для контрастирования неспецифического свечения туляремийную люминесцирующую сыворотку используют вместе с бычьим альбумином, меченным родамином, который сообщает клеткам и тканям, а также прочим органическим включениям, содержащимся в исследуемых препаратах, оранжево-красное неспецифическое свечение различных оттенков.

Сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку и сухой бычий альбумин растворяют в указанных на этикетках ампул объемах дистиллированной воды. Затем непосредственно перед нанесением на препарат люминесцирующую туляремийную сыворотку и меченый бычий альбумин разводят физиологическим раствором рН 7,0 - 7,2, доводя до их рабочего разведения, указанного на ампуле. Далее каплю смеси туляремийной люминесцирующей сыворотки и меченного родамином бычьего сывороточного альбумина наносят на фиксированный и подсушенный препарат, равномерно распределяя смесь по всему препарату, и помещают его во влажную камеру. "Окраску" препарата производят в течение 20 мин. при комнатной температуре (18 - 20 °С). По окончании "окраски" препарата каплю смеси люминесцирующей сыворотки и меченого бычьего альбумина стряхивают и препарат промывают в течение 5 - 10 мин. проточной водопроводной водой или в нескольких сменяемых порциях физиологического раствора (рН 7,2 - 7,4). Затем препарат подсушивают на воздухе, наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина + 1 часть физиологического раствора рН 7,2 - 7,4) и покрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Такой препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Учет и оценка РИФ. Мазки просматривают в падающем свете люминесцентного микроскопа с лампой ДРШ-250 и системой светофильтров. Используют иммерсионный объектив 90х (1,26) и окуляры 5х или 7х. При микроскопировании используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

В положительных случаях, т.е. когда исследуемый материал содержит туляремийные бактерии, в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое изумрудно-зеленое свечение туляремийных бактерий. Удается обнаружить более яркое свечение периферии бактериальной клетки и более слабое - в ее центральной части. Посторонние микроорганизмы, клетки ткани и прочие органические частицы приобретают оранжево-красную (различных оттенков) флуоресценцию. Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему регистрации результатов. Положительным результатом считается флуоресценция, оцениваемая на ++++ или +++ при достаточном количестве (2 - 5 клеток в нескольких полях зрения микроскопа) специфически флуоресцирующих бактерий. При оценке исследуемого препарата необходимо учитывать не только интенсивность специфического свечения, но и обращать особое внимание на характерную морфологию бактерий и учитывать расположение клеток относительно друг друга.

При исследовании различных препаратов необходимо иметь контрольный мазок, приготовленный из взвеси туляремийных бактерий и обработанный подобно опытным образцам.

3.4. В качестве дополнительного метода диагностики туляремии у человека может быть рекомендовано обнаружение специфической ДНК в патологическом материале современным методом молекулярной биологии с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Заместитель Руководителя

Департамента госсанэпиднадзора

С.И.ИВАНОВ

Приложение N 5

к Приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14 апреля 1999 г. N 125

Главным государственным санитарным врачом РФ 09.09.2005 взамен данных методических указаний введены в действие Методические указания МУ 3.1.2007-05.