Определение понятие мембранного потенциала. Методы измерения мембранного потенциала

Обычно мембранный потенциал обозначают как Dj, представляющий разность потенциалов внутренней и наружной поверхности мембраны

Dj = j_вн-j_нар= j_м

Прогресс в исследовании биопотенциалов обусловлен:

1) разработкой микроэлектродного метода внутриклеточно­го измерения потенциалов;

2) созданием специальных усилителей биопотенциалов (УПТ);

3) выбором удачных объектов исследования крупных клеток и среди них гигантского аксона кальмара. Диаметр аксона кальмара достигает 0,5 мм, что в 100 - 1000 больше, чем диа­метр аксонов позвоночных животных, в том числе человека. Гигантские, в сравнении с позвоночными, размеры аксона этого проворного и ловкого головоногого моллюска — имеют большое физиологическое значение - обеспечивают быструю передачу нервного импульса по нервному волокну (слайд 2).

Для биофизики гигантский аксон кальмара послужил вели­колепным модельным объектом для изучения биопотенциалов (недаром выдвигались предложения поставить памятник каль­мару - животному, которому так многим обязана наука, подоб­но существующим памятникам лягушке в Париже и собаке под С. -Петербургом).

В гигантский аксон кальмара можно ввести микроэлектрод, не нанеся аксону значительных повреждений.

Микроэлектродный метод дал возможность измерить биопо­тенциалы не только на гигантском аксоне кальмара, но и на клет­ках нормальных размеров: нервных волокнах других животных, клетках скелетных мышц, клетках миокарда и других.

Однако, несмотря на преимущества и достаточную простоту, этот способ применим лишь для плоских модельных мембранных систем и некоторых крупных клеток. Если нужно измерить потенциал на мембране либо протеолипосом, либо клеток или органелл, например митохондрий или хлоропластов, то метод прямого измерения потенциала не применим. Для этих случаев разработано несколько методов.

1. Распределение ионов в соответствии с уравнением Нернста. В систему добавляют ион, способный проникать через мембрану, и он перераспределяется между внешней средой и внутренним объемом в соответствии с уравнением Нернста. На этом принципе основано использование в качестве молекулярных зондов таких гидрофобных ионов, как ТФФ+ или 86Rb-валиномицин. Чтобы определить трансмембранный потенциал, нужно знать концентрацию иона внутри везикулы, органеллы или клетки, что нередко превращается в серьезную проблему. Ошибки в измерении мембранного потенциала могут, в частности, возникнуть, если большие количества молекул-зондов связываются с мембранами клетки или если неправильно определен внутренний объем.

2. Спин-меченные ЭПР-зонды. Для этой цели используют несколько зондов — гидрофобных ионов, к которым ковалентно пришита парамагнитная нитроксильная группа. Концентрацию зонда, связанного с мембраной, легко определить из спектра ЭПР; при образовании на мембране потенциала зонд перераспределяется между фазами, и по изменению его концентрации в мембране можно оценить величину разности потенциалов. Изменение концентрации мембраносвязанного зонда обусловлено тем, что для внутривезикулярного пространства отношение площади поверхности к объем гораздо больше, чем для внешнего раствора.

3. Оптические молекулярные зонды. Спектральные характеристики многих оптических зондов зависят от трансмембранного потенциала. Наиболее распространенные это флуоресцентные производные мероцианина, оксонола и цианиновые красители. Все эти соединения связываются с мембраной, и, по-видимому, в основе их реакции на изменения трансмембранного потенциала может лежать несколько механизмов. Чаще всего это взаимодействие электрического диполя, каким является зонд, с электрическим полем приводит к изменению ориентации диполя в биослое. В ряде случаев изменение степени агрегации зонда в бислое влечет за собой изменение квантового выхода флуоресценции. Большинство зондов применяют для определения трансмембранного потенциала имеющего знак минус внутри везикулы, однако некоторые красители, например оксонолы, используются при обратной поляр ности потенциала.

К зондам другого типа, спектр поглощения которых чувствителен к трансмембранному потенциалу, относятся соединения стирольной природы, образующие в мембране конъюгированные структуры. Изменение их спектров поглощения при наложе­нии потенциала обусловлено так называемым явлением электрохромизма. Переход молекулы зонда из основного состояния в возбужденное при поглощении кванта света сопровождается перераспределением электронов. На энергию электронного перехода влияет градиент потенциала, вектор которого параллелен направлению этого смещения заряда. Подобные электрохромные изменения спектра наблюдаются также для природных пигментов фотосинте­тических мембран — каротиноидов. Преимущество зондов этого типа состоит в том, что соответствующие реакции происходят очень быстро и не зависят от степени агрегации или распреде­ления зонда. Все эти свойства делают такие зонды особенно полез­ными для быстрых кинетических измерений.