Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов отдельных аминокислот

Микроорганизмы обычно синтезируют каждую из аминокислот в определенных количествах, обеспечивая тем самым синтез специфических белков. Это объясняется тем, что контроль за скоростью биосинтеза каждой аминокислоты осуществляется по принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уровне самих ферментов, способных под действием избытка образующихся аминокислот изменять свою активность (ретроингибирование). Такой контроль исключает, перепроизводство аминокислот, и выделение их из клетки возможно лишь у микроорганизмов с нарушенной системой регуляции. Такие культуры иногда выделяют из природных источников.

Основной путь селекции продуцентов аминокислот — получение ауксотрофных и регуляторных мутантов. Ауксотрофные мутанты отбирают на селективных средах после воздействия на суспензии бактериальных культур физическими (например, ультрафиолетовое или рентгеновское излучение) и химическими (этиленимин, диэтилсульфат, нитрозоэтил-мочевина и т. д.) факторами. У таких мутантов появляется дефектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Получение ауксотрофных мутантов — продуцентов аминокислот — возможно только для микроорганизмов, имеющих разветвленный путь биосинтеза, по крайней мере, двух аминокислот, образующихся из одного предшественника. Их биосинтез контролируется на уровне первого фермента общего участка согласованным ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование). У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Аминокислота, биосинтез которой блокирован в результате мутагенного воздействия, должна добавляться в ограниченном количестве.

Регуляторные мутанты отбирают среди культур, устойчивых к аналогу целевой аминокислоты. Этот метод позволяет отобрать мутанты, у которых имеются нарушения в системе регуляции образования целевой аминокислоты, а некоторые из них оказываются способными к ее повышенному синтезу и выделению из клетки.

L-Глутаминовая кислота — первая аминокислота, полученная на основе промышленного микробиологического синтеза. В качестве продуцентов брали дикие штаммы глутаматпродуцирующих коринебактерий. В условиях, обеспечивающих нормальный рост этих культур, сверхсинтеза этой аминокислоты не происходит. «Перепроизводство» этого продукта дикими штаммами коринебактерий вызывается особыми физиологическими условиями, когда рост клеток тормозится, а в клеточной мембране происходят структурные и функциональные изменения, приводящие к проницаемости ее для глутаминовой кислоты. Такие условия создаются при лимите в среде биотина (1-5 мкг/л). В результете интенсивного выделения из клетки образуемой глутаминовой кислоты ее внутриклеточная концентрация резко снижается и регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает. В таких условиях даже дикие штаммы способны превращать в глутаминовую кислоту до 50% используемого источника углерода.

Селекционная работа с продуцентами этой аминокислоты идет главным образом в направлении получения ауксотрофных мутантов, отличающихся слабой активностью а-кетоглутаратдегидрогеназы (фермента, включающего предшественник глутаминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот), Основной селекционный прием — ступенчатый отбор после мутагенного воздействия и оценка мутантов на средах с повышенным содержанием биотина (до 30 мкг/л). Такие штаммы необходимы в связи с применением в производстве мелассных сред, содержащих высокие концентрации биотина.

L-Лизин синтезируется микроорганизмами двумя принципиально различными путями. Микроводоросли, грибы, дрожжи синтез лизина осуществляют из а-кетоглутаровой кислоты через α-аминоадипиновую кислоту (АА путь). Для бактериальных культур, высших растений, некоторых водорослей характерен другой путь биосинтеза лизина — через а-диаминопимелиновую кислоту (ДАП-путь), начинающийся с аспарагиновой кислоты. Кроме лизина по разветвленной схеме биосинтеза из аспартата образуются метионин, треонин и изолейцин. Установлено, что контроль биосинтеза аминокислот семейства аспартата осуществляется на уровне первого фермента β-аспартокиназы (АК). Продуценты лизина — глутаматпродуцирующие коринебактерии Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum — имеют единственную АК, активность которой регулируется путем согласованного ингибирования по принципу обратной связи треонином и лизином. Синтез треонина зависит от активности гомосериндегидрогеназы (ГД), синтез лизина катализируется первым ферментом лизиновой ветви пути — дигидродипиколинат синтетазой (ДДПС). Общий предшественник в синтезе лизина и треонина — полуальдегид аспарагиновой кислоты – у диких штаммов коринебактерий расходуется преимущественно на синтез треонина, так как активность ГД в 15 раз выше, чем ДДПС-активность, т. е. фактически биосинтез лизина начинается после насыщения клетки треонином, метионином и изолейцином. В связи с этим для получения сверхпродукции лизина необходимо заблокировать биосинтез этих метаболитов, что возможно путем подавления активности ГД или гомосеринкиназы (ГК). У глутаматпродуцирующих культур это достигается воздействием мутагенных факторов на прототрофные штаммы. Известны три класса лизинпродуцирующих мутантов:

Date: 2015-08-07; view: 2699; Нарушение авторских прав