Микробиологический синтез триптофана

У бактерий и многих других организмов аминокислота триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая кислота.

Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую. Такое блокирование достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез аминокислоты триптофана, однако для нормального развития этих мутантов в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты — фенилаланин и тирозин в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана.

В целях промышленного получения незаменимой аминокислоты триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов бактерии Bacillus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по такой же схеме, как и получение лизина.

Ферментация длится 48 ч при 37С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110-120 С. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ). При получении высококонцентрированных препаратов триптофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке. Высушенный кристаллический препарат содержит не менее 99% триптофана в виде его хлорида.

В нашей стране синтез триптофана производится по двухступенчатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают предшественник триптофана — антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан.

Биохимическое превращение антраниловой кислоты в триптофан проходит в три этапа. На первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилпирофосфата (ФРПФ) образуется аминогликозид — N (5- фосфорибозил)- антраниловая кислота, которая далее в результате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превращаются в индол-3- глицерофосфат. На последнем этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индолглицерофосфата и аминокислоты серина осуществляется синтез триптофана.

В связи с тем, что в качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит скорость превращения антраниловой кислоты в триптофан.

В качестве источника ферментов для указанных реакций используются дрожжи.

Производственный процесс биохимического превращения антраниловой кислоты в триптофан проводится в две стадии. На первой стадии наращивается биомасса дрожжей, являющихся продуцентами ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины и минеральных солей. Ферментация продолжается в течение 24 ч при 30 С. Далее в ферментер начинают вводить спиртовой 5% -ный раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор мочевины.

Через 3-4 ч после добавления антраниловой кислоты в ферментер дополнительно подается углеродный субстрат — меласса в виде 25%-ного раствора. На последующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы - через каждые 12 ч.

Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей — 144 ч. Содержание триптофана в культуральной среде составляет 0.3-0.5% или примерно 6 г/л. После упаривания и сушки получают кормовой концентрат триптофана, годфжащий 90% сухого вещества, 48-54% белков, 1-3% триптофана, витаминов группы В и др.