Крупномасштабное производство лекарственных препаратов

Источником большинства лекарственных препаратов, поступающих в аптеку, является медицинская промышленность. Различают следующие самостоятельные отрасли медицинской промышленности: химико-фармацевтическая, галенофармацевтическая и промышленность а/б, органопрепаратов и витаминов. К химико-фармацевтической промышленности относятся производство синтетических веществ и активных фармакологических веществ, выделение в чистом виде из природного сырья. Наряду с крупномасштабной фармацевтической промышленностью развиваются фармацевтические фабрики, которые относятся к аптечным управлениям и занимаются выпуском галеновых препаратов (настойки, экстракты), для производства которых, требуется относительно несложное оборудование.

Фармацевтические заводы построены по цеховому принципу, обычно они имеют 4 основных цеха:

1) галеновый; 2) таблеточный; 3) ампульный; 4) фасовочный.

В галеновом цехе сосредоточено производство экстрактов и настоек, а также новогаленовых препаратов, биогенных стимуляторов и т.д. В этом цехе производится экстрагирование растительного сырья различными методами (мацерация, перколяция, циркуляция и др.), операции по разделению жидких и твердых фаз (отстаивание, фильтрование, прессование) отгонка спирта и других экстрагентов, выпаривание, сушка под вакуумом, растворение, смешение и т.д.

В таблеточном цехе изготовляются таблетки, представляющие собой спрессованные порошкообразные смеси Основные производственные операции в этом цехе – измельчение исходных веществ, смешение, гранулирование массы и таблетирование.

В ампульном цехе изготовляются растворы в ампулах для инъекций. Здесь производственный цикл складывается из растворения исходных веществ, фильтрация растворов, изготовление ампул, подготовка их к накоплению (мойка и др. операции), наполнение, запайки, стерилизация и этикетирови.В фасовочном цехе фасуется продукция, вырабатываемая заводом. На каждом фармацевтическом заводе, кроме основных цехов имеются подсобные цеха и отделения, которые обслуживают основные цеха. Сюда относятся: котельная, картонажная мастерская, складские помещения и т.д.Особое место занимает на заводе отдел технологического контроля, (ОТК), осуществляется контроль на всех участках производства и санкционирующий выпуск готовой продукции с завода.Большие фармацевтические заводы относятся к категории крупносерийных производств. Для них характерны применение поточного метода, максимальные механические производственные процессы и в ряде случаев полная автоматизация производства.

Использование методов рекомбинантной днк в медицинской и ветеринарной биотехнологии. Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;конструирование рекомбинантной ДНК;гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы. Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стиму­лируют деятельность иммунной системы и препятствуют размно­жению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интер­феронов важны с точки зрения их терапевтического применения. Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток — используют для диагностики различных заболеваний. Об­ладая высокой специфичностью действия, они обеспечивают иден­тификацию не только вида возбудителя, но и его серотипа. С по­мощью моноклональных антител можно тестировать различные гормоны, метаболиты, белковые факторы. Наиболее быстрый ме­тод индикации основан на применении антител, иммобилизован­ных на мембранных электродах — аналогах ферментных биосен­соров. Они позволяют диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, ревматоидному артриту (J. Col-lins et al., 1986), идентифицировать наследственные заболе­вания, сопровождающиеся утратой тех или иных ферментов и других белковых компонентов. Моноклональные антитела широко используют для диагностики рака и определения его форм.

Генно-инженерное микробиологическое производство. Генно-инженерные лекарственные препараты, появившиеся на рынке в последнее десятилетие, представляют собой естественные природныебиорегуляторы и биологически активные вещества, синтез которых для медицинских целей вне организма невозможен или весьма затруднителен. К таким препаратам относятся инсулин, гормон роста, урокиназа, факторы свертывания крови, эритропоэтин, интерлейкины и их ингибиторы, колониестимулирующие факторы и факторы роста, артериальный натрийуретический фактор, супероксиддисмутаза, ангиогенин, тканевый активатор плазминогена, вакцины, моноклональные антитела.Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пептидных гормонов. Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось много материала для получения небольшого количества продукта.Так, человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека, каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в неделю; курс лечения должен продолжаться несколько лет. С применением генноинженерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования, что гораздо дешевле. Открываются перспективы борьбы не только с карликовостью, но и с низкорослостью – более слабой степенью дефицита соматотропина. Соматотропин способствует заживлению ран и ожогов, наряду с кальцитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са²⁺ в костной ткани.Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генно-инженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей, что также означает уменьшение затрат на производство лекарственного средства.Моноклональные антитела (МА) занимают ведущее место среди разрабатываемых биотехнологических продуктов. МА давно нашли применение в иммунодиагностике, а в последнее десятилетие растет их роль в терапии рака и других заболеваний.Вакцинация – один из основных способов борьбы с инфекционными заболеваниями. Путем поголовной вакцинации ликвидирована натуральная оспа, резко ограничено распространение бешенства, полиомиелита, желтой лихорадки. Необходимо изготовление вакцин против гриппа, гепатитов, герпесов, свинки, кори, острых респираторных заболеваний. Большое экономическое значение имеет разработка вакцин против болезней сельскохозяйственных животных – ящура, африканской болезни лошадей, овечьей болезни «синего языка», трипаносомозов и других. Традиционные вакцинные препараты изготовляют на основе ослабленных, инактивиро-ванных или дезинтегрированных возбудителей болезней.Современные биотехнологические разработки предусматривают создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вакцины обоих типов основаны на генноинженерном подходе. Среди наиболее активно разрабатываемых генно-инженерных продуктов находятся препараты группы цитокинов – интерлейкины, а также вещества родственной группы – антагонисты рецепторов интерлейкинов. Эти препараты перспективны для лечения опухолевых, воспалительных, автоиммунных заболеваний, а также тяжелых форм болезней крови. В 2008 году в стадии клинических испытаний и на этапе регистрации находилось 633 биотехнологических препарата для лечения более 100 заболеваний. Основные направления, по которым в данное время ведутся исследования, это – разработка препаратов для лечения тяжелых форм рака, ВИЧ, аутоиммунных заболеваний, болезни Альцгеймера, сердечно-сосудистых заболеваний.

Определение генетической инженерии. Общепринятого определения генетической инженерии не существует. Если следовать традиционному пониманию термина "инженерия", то генетическую инженерию можно трактовать как искусство использовать знания основ и методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами.

История собственно генетической инженерии насчитывает уже более 30 лет. Ее дальняя предыстория уходит корнями в развитие методов классической генетики. Основную роль в начальный период сыграл количественный анализ, введенный Менделем в 60-е годы прошлого столетия в работы по изучению законов поведения наследственных признаков. Он помог выявить главные генетические закономерности и сформулировать понятие о единице наследственности — гене. Тем не менее, вплоть до середины нашего столетия генетические методы оставались формальными, так как молекулярная база законов наследственности и материальная природа генов оставались неизвестными.

Ближняя предыстория генетической инженерии началась более полувека назад с открытия генетической роли ДНК (Avery et al., 1944). Широкое использование в биологии физико-химических методов, введение в практику прецизионных приборов и устройств позволили перейти к анализу генетических структур и функций на молекулярном уровне. Было выяснено строение молекул ДНК (Watson, Crick, 1953) и белка (Pauling, Corey, 1951). Это привело к формированию нового раздела в генетике — молекулярной генетики, достижением которой явилось установление того факта, что гены не только кодируют структуру определенных продуктов (как правило, белков), но и регулируют процесс их синтеза (Jacob, Monod, 1961). Впоследствии был расшифрован генетический код (1961—1966) и выяснено строение элементов, управляющих действием прокариотических генов и синтезом белков: промоторов, операторов, сайтов связывания рибосом, терминаторов транскрипции и трансляции и др.

Достойное место в предыстории генетической инженерии занимают работы Жакоба, проведенные в середине 60-х годов. С помощью целенаправленных генетических операций методами рекомбинации in vivo он сумел подчинить структурную часть одного оперона регуляторным элементам другого. В то же время в его лаборатории было доказано, что перемещение оперона вместе со всеми собственными регуляторными элементами в другую область хромосомы не отражается заметным образом на его способности к экспрессии (Signer, Beckwith, 1966). Результаты этих экспериментов находятся у истоков генетической инженерии in vivo и составляют основу современных методов решения задач по экспрессии клонируемых генов. Важную роль в становлении генетической инженерии сыграло открытие явления специфической транс-дукции бактериальных генов некоторыми умеренными фагами (Morse et al, 1956). Оно дало возможность сформировать представление о векторах, т.е. молекулах — переносчиках генов, и подсказало пути извлечения генов из клеточного генома.

Обнаружение явления рестрикции и модификации ДНК у бактерий и раскрытие его механизма (Arber, Dussoix, 1962; Dussoix, Arber, 1962) позволили идентифицировать целый класс рестрици-рующих эндонуклеаз (Smith, Wilcox, 1970; Kelly, Smith, 1970), что и открыло путь к разработке технологии рекомбинантных ДНК. Энзимология нуклеиновых кислот предоставила в распоряжение "генных инженеров" обширный "инструментарий" для всевозможных манипуляций с ДНК, а генетика микроорганизмов подсказала им способ введения сконструированных in vitro молекул ДНК в реципиентные клетки путем их трансформации. Поэтому в последующие годы методы in vitro, позволившие синтезировать, выделять, рекомбинировать и перемещать гены, получили широкое распространение в практике молекулярных генетиков.

Инсулин. Инсулин (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, образуется в β-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови.

Инсулин увеличивает проницаемость плазматических мембран для глюкозы, активирует ключевые ферменты гликолиза, стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена, усиливает синтез жиров и белков. Кроме того, инсулин подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры. То есть, помимо анаболического действия, инсулин обладает также и антикатаболическим эффектом.

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции β-клеток — абсолютная недостаточность инсулина — является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани — относительная инсулиновая недостаточность — имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

Строение. Молекула инсулина образована двумя полипептидными цепями, содержащими 51 аминокислотный остаток: A-цепь состоит из 21 аминокислотного остатка, B-цепь образована 30 аминокислотными остатками. Полипептидные цепи соединяются двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина, третья дисульфидная связь расположена в A-цепи.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками.Действие инсулина. Так или иначе инсулин затрагивает все виды обмена веществ во всём организме. Однако в первую очередь действие инсулина касается именно обмена углеводов. Основное влияние инсулина на углеводный обмен связано с усилением транспорта глюкозы через клеточные мембраны. Активация инсулинового рецептора запускает внутриклеточный механизм, который напрямую влияет на поступление глюкозы в клетку путём регуляции количества и работы мембранных белков, переносящих глюкозу в клетку. В наибольшей степени от инсулина зависит транспорт глюкозы в двух типах тканей: мышечная ткань (миоциты) и жировая ткань (адипоциты) — это т.н. инсулинозависимые ткани. Составляя вместе почти 2/3 всей клеточной массы человеческого тела, они выполняют в организме такие важные функции как движение, дыхание, кровообращение и т. п., осуществляют запасание выделенной из пищи энергии.Механизм действия. Подобно другим гормонам своё действие инсулин осуществляет через белок-рецептор. Инсулиновый рецептор представляет собой сложный интегральный белок клеточной мембраны, построенный из 2 субъединиц (a и b), причём каждая из них образована двумя полипептидными цепочками. Инсулин с высокой специфичностью связывается и распознаётся А-субъединицей рецептора, которая при присоединении гормона изменяет свою конформацию. Это приводит к появлению тирозинкиназной активности у субъединицы b, что запускает разветвлённую цепь реакций по активации ферментов, которая начинается с самофосфорилирования рецептора. Существует много способов производства препаратов инсулина "человека" и я представлю свой взгляд на эту проблему, а также укажу, какие фирмы используют описанные методы производства.

1. Естественный инсулин человека можно получить путем вытяжки, кристаллизации и очистки ткани поджелудочной железы трупа человека, аналогично тому, как инсулин получают из поджелудочной железы коров или свиней. 2. Полусинтетический инсулин человека можно получить биохимическим методом из естественного свиного инсулина, удалив в свином инсулине одну аминокислоту В30 (Аланин) и вставив взамен другую аминокислоту Треонин. 3. Синтетический инсулин человека и "аналоги" инсулина человека могут быть произведены, по крайней мере, 3 различными способами, причем в двух из них используются различные типы клеток (бактерия кишечной палочки и дрожжевые клетки), но процесс производства практически совпадает: