Методичні вказівки до вивчення питань теми. Методи дослідження кров'яних слідів

Методи дослідження кров'яних слідів

Під час огляду місця події сліди крові можуть бути представлені у вигляді калюж, плям від крапель або від бризок, патьоків, затьоків, помарок (мазків або відбитків), просякувань. За зовнішнім виглядом сліди крові можуть мати червоний, брунатний або зеленкуватий колір, якщо вони давні. При їх опроміненні ультрафіолетовим світлом свіжі сліди крові мають темно-брунатний колір, а давні - помаранчово-червоний. В деяких випадках проводять попередні проби на кров. Після описання сліду крові проводять вилучення зразку. При цьому необхідно дотримуватись таких вимог:

1. Якщо зразок речового доказу, наприклад, крові, можливо вилучити з предметом-носієм, на якому він розташований, то такий слід крові вилучають разом з його носієм.

2. Якщо зразок речового доказу вилучити з предметом-носієм неможливо, то його вилучають шляхом зскрібання лезом з поверхні, на якій він розташований, або шляхом змивів, протираючи до-сліджувальну поверхню ватно-марлевим тампоном, змоченим дистильованою водою.

3. Якщо речовий доказ біологічного походження розташований на біологічному зразку або на зразку, що має біологічні складові, наприклад, на дереві, грунті, то вилучають зразок носія з речовим доказом та зразок носія без речового доказу для контролю.

4. Якщо речовий доказ розташований на носії, який може змінити свій агрегатний стан, наприклад, сніг, лід, то зразок носія з речовим доказом розміщують у воронці, на дні якої наявна складена в декілька шарів марля, розтоплюють носій при кімнатній температурі, в наслідок чого на марлі залишаються сліди речового доказу.

5. Всі вологі речові докази біологічного походження підлягають попередньому висушуванню за умов відсутності прямої дії тепла та сонячного світла.

Судово-медична експертиза крові

1. Встановлення наявності крові

Для встановлення наявності крові використовують попередні (орієнтовні) та доказові проби.

а) Орієнтовне дослідження слідів крові може бути проведено за такими основними методиками:

за кольором сліду крові при візуальному його огляді;

за кольором сліду крові при освітленні ультрафіолетовим світлом.

Предмети, на яких наявні сліди, що нагадують кров, розміщують на площадці ртутно-кварцевої лампи, яка є джерелом ультрафіолетового випромінювання, та роздивляються їх у темряві. При наявності свіжих слідів крові виявляють плями темно-брунатного кольору, а старі плями мають помаранчово-червоний колір. Такі підозрілі на кров місця обшивають нитками та помічають порядковим номером.

за допомогою хімічних реакцій, що виявляють активність ферментів — каталази і пероксидази крові.

Для виявлення наявності каталази використовують 3 % розчин перекису водню, який наносять капіляром на поверхню матеріалу з можливими слідами крові. Позитивним результатом вважають утворення стійкої дрібнопухирчастої піни, яке відбувається внаслідок виділення вільного кисня при розкладанні реактиву під дією каталази.

Для виявлення наявності пероксидази використовують реактиви, що складаються з суміші 3 % розчину перекису водня та хромогенного субстрату, наприклад, 1 % спиртового розчину бензидину. До поверхні, підозрілої на кров'яний слід, торкаються ватяним тампоном, зволоженим реактивом.

У разі присутності крові, рідина на тампоні змінює свій колір, оскільки пероксидаза крові сприяє окисленню хромогенного індикатора і утворенню кольорової реакції.

Внаслідок широкого поширення вказаних вище ферментів в природі та їх нестійкості позитивний і негативний результати реакції можуть мати лише орієнтовне значення.

Для виявлення зовні невидимих слідів крові під час огляду місця події використовують розчин люміналу, яким обприскують досліджувані ділянки. У разі наявності крові на цих ділянках з'являються блакитні спалахи.

б) Дослідження доказовими методами дозволяє виявити гемоглобін або його похідні для чого застосовують наступні методи дослідження.

1. Спектральне дослідження

Під час спектрального дослідження виявляють спектр гемоглобіну або його похідних.

Із свіжих слідів крові, які добре розчиняються у воді, готують витяг, розчиняючи кров у дистильованій воді, яку досліджують спектроскопом прямого бачення. Витяг повинен бути світло-рожевого кольору. Якщо кров є свіжою, то в спектрі відмічають дві смуги поглинання в жовто-зеленій частині спектра між Фраунгоферовими лініями Д та Е, які властиві оксигемоглобіну. Інші похідні гемоглобіну мають своє розташування смуг поглинання.

Досить часто при дослідженні свіжих та змінених плям крові використовують мікроспектральне дослідження таких плям. Підозрілі на наявність крові плями обробляють відповідними реактивами для отримання спектрів гемохромогену та гематопорфірину.

Для отримання спектру гемохромогену на предметному склі розміщують зіскоб з плями або розволокнену нитку, до яких добавляють 2-3 краплі розчину їдкого луга та на кінчику леза ножа від-новлювач — гідросульфіт натрію. Препарат покривають покровним склом та вивчають під мікроскопом. В препараті наявні шибки гемохромогену рожево-червоного кольору, з яких обирають найбільш прозору та рожеву глибку та розміщують її в центрі мікроскопа. Для виявлення спектра гемохромогену окуляр мікроскопа замінюють на спектральну насадку АУ-16.

Позитивним результатом вважають виявлення в шкалі в жовто-зеленої частини спектра між лініями Д і Е двох смуг поглинання, з яких одна ліва більш вузька, а права розпливчаста.

Для отримання спектра гематопорфірину об'єкт дослідження розміщують на предметному склі, вносять 1-2 краплі концентрованої сірчаної кислоти та накривають покровним склом. Під мікроскопом виявляють ділянки фіолетово-червоного кольору, з яких обирають найменш забарвлену та розміщують її в центрі мікроскопа. Надалі її вивчають за допомогою спектральної насадки. Позитивним результатом вважають виявлення двох і більше смуг поглинання в жовто-помаранчовій частині спектра.

Присутність крові у слідах вважають абсолютно доведеним за умов позитивного результату виявлення або гемохромогену, або гематопорфірину. Висновок про відсутність слідів крові базується на негативному результаті виявлення обох похідних гемоглобіну. У

випадках, коли плями крові знаходяться на залізних предметах, то при обробці їх сіркомісткими реактивами може утворюватися сірчане залізо, яке змінює звичайний спектр гемоглобіну, що обумовлює необхідність використання реактиву Така яма для отримання спектру гемохромогену.

2. Мікрокристалічні реакції

За допомогою мікрокристалічних реакцій отримують кристали геміна гідрохлориду та гемохромогена.

Для отримання кристалів гемін-гідрохлориду, що мають назву кристалів Тейхмана, на предметне скло вміщують ретельно розво-локненні нитки матеріалу, вирізані з сліду крові, або його зіскоб. До них додають 3-4 невеликих кристалів куховарської солі і препарат покривають покривним склом, під яке підводять 2-3 краплі крижаної оцтової кислоти. Після цього препарат підігрівають над полум'ям горілки до моменту появи перших пухирців кипіння. Мікроскопічне виявлення кристалів проводять після охолонення препарату. Позитивним результатом вважають виявлення в полях зору мікроскопа кристалів у вигляді паралелограмів брунатного кольору.

Для отримання кристалів гемохромогена використовують реактив Такаяма, який складається з рівних частин 10% розчину їдкого натру, піридину і насиченого водяного розчину глюкози. Цей реактив додають до розташованого на предметному склі подрібненого матеріалу або зіскобу. Отриманий препарат піддають мікроскопічному дослідженню.

Позитивним результатом вважають виявлення поліморфних вишнево-червоного кольору кристалів у формі ромбів або голок з роздвоєними кінцями, які можуть розташовуватися у вигляді снопів, зірок або поодиночно.

Примітка: описані реакції мають невисоку чутливість, утворенню кристалів можуть перешкоджати домішки іржі, клейові фарби, сильне висихання крові в слідах, гнильні зміни, а також технічні погрішності в проведенні дослідження.

3. Метод флуоресцентної мікроспектроскопії

Цей метод призначений для виявлення крові в слідах малої величини (мікрооб'єктах) або крові, що зазнала несприятливих впливів - замиванню, дії хімічних речовин, гнильним змінам тощо.

В основі методу наявний все той же принцип мікроспектраль-ного дослідження, поріг чутливості якого підвищено за рахунок до-

слідження спектру флюоресценції гематопорфірину, який виявляють за допомогою люмінесцентного мікроскопа і тієї ж мікроспек-тральної насадки. Лабораторії експертних установ використовують мікроскоп моделі "Люмам-31 А".

Методика дослідження в принципі не відрізняється від описаної вище при дослідженні спектра поглинання гематопорфирина.

Позитивним результатом вважають виявлення в шкалі мікроспе-ктральної насадки яскраво-пурпурової флюоресценції в жовто-по-маранчовій ділянці спектра. При роботі в незатемненому приміщенні на фоні цієї флуоресціюючої ділянки можна бачити дві смуги поглинання гематопорфирина, що підвищує специфічність методу флуоресцентної мікроспектроскопії.

4. Біохімічне виявлення гемоглобіну

Для біохімічного виявлення гемоглобіну досить часто використовують метод тонкошарової хроматографії.

Цей метод дозволяє встановити присутність крові в мікрооб'єктах.

Дослідженню піддають слабо концентровані витяги з підозрілих на присутність крові слідів і предмета-носія в ізотонічному розчині хлорида натрію. Як "свідок" міграції в процесі хроматографії використовують розчин явної крові в такій же концентрації.

Хроматографію проводять на спеціальних пластинах фольги, вкритої шаром сорбенту.

На практичному занятті студенти самостійно проводять розмітку пластини "Силуфол", відмічаючи легким натиском скальпеля лінії "старт" і "фініш". Першу відмічають на відстані 2 см від нижнього краю пластини, другу - на відстані 12 см від старту. Після цього проводять нанесення заздалегідь підготовлених витягів (щеплення зразків). При цьому рекомендують наносити по 2-3 краплі кожного з об'єктів так, щоб в місцях щеплення сформувалися плями біля 0,2 см в діаметрі, причому, кожну подальшу краплю наносять після підсихання попередньої.

Підготовлену таким способом пластину піддають хроматогра-фуванню. Процес цей здійснюють в камерах, за які можуть слугувати скляні судини місткістю біля 1 літра.

Пластини вертикально вміщують в камери, на дно яких наливають розчинник (суміш бутанола, дистильованої води і оцтової кислоти) так, щоб він покривав лінію старту з щепленням.

Процес хроматографування триває біля 90 хвилин, за які гемоглобін крові майже досягає рівня фінішної лінії.

Для виявлення локалізації цього кров'яного білка застосовують реактив-проявник, який складається з суміші 1 % спиртових розчину основного бензидина і 3 % розчину перекису водня. Цим реактивом запилюють поверхню пластини, використовуючи розбриз-кувач. У разі присутності крові пляма кров'яного білка набуває синього кольору (пероксидазна активність).

Безумовним доказом присутності крові служить одночасне виявлення синього забарвлення плями кров'яного білка та "свідка" при відсутності такого з боку предмета-носія.

Також характерним показником позитивного результату являється показник МЧ),83, який є статистичне доведеним показником довжини пробігу кров'яного білка на пластині сорбента у заданих умовах.

5. Встановлення наявності крові діагностичними смужками "Ге-мофан"

Діагностичні смужки "Гемофан" дозволяють встановити наявність крові у витягах з її сліду за умов розведення навіть вище, ніж 1:16000, а також при вивченні замитих слідів крові.

Витягом з досліджувальної плями змочують діагностичну смужку "Гемофан" та визначають, який колір вона набула. У випадку появи синьо-блакитного або зеленкуватого кольору встановлюють наявність крові в досліджувальній плямі.

2. Встановлення видової належності крові в її слідах

При визначенні виду білка важливе практичне значення має реакція преципітації в рідкому середовищі, що має назву реакції Чи-стовича-Уленгута, та реакції преципітації в твердих середовищах -реакція імунодифузіїв агарі і метод зустрічного імуноелектрофоре-зу (електропреципітації) як в агарі, так і на ацетат целюлозних плівках.

У всіх варіантах реакції преципітації використовують діагностичні преципітуючі сироватки, отримані шляхом імунізації гетерогенних тварин.

а) Реакція Чистовича-Уленгута

Дослідженню піддають заздалегідь підготовлені витяги з плям крові в ізотонічному розчині хлориду натрію, контрольні розчини білка людини та 2-3 тварин. Контрольні досліди дозволяють підтвердити активність і специфічність діагностичних реагентів, що використовуються.

Відповідно порогу чутливості даної реакції, оптимальною концентрацією білка у витягах є 1:1000, яка досягається за допомогою розведення витягів ізотонічним розчином під контролем проби з концентрованою азотною кислотою (проба Геллера).

Для з'ясування специфічності сироватки використовують ряд пробірок з відтягнутим дном. У першу з них на дно вміщують витяг об'єкта з досліджуваною кров'ю, у другу - витяг з предмета-носія, в третю - витяг з завідомо відомої крові людини, а в наступні - беруть витяги крові різних тварин.

Потім в пробірки пастеровськими піпетками вносять діагностичні преципітуючі сироватки людини таким чином, щоб рідини не перемішувалися.

На позитивний результат реакції при спостереженні впродовж 1 години (час специфічної активності преципітуючих сироваток) вказує утворення на межі зіткнення двох рідин осаду у вигляді кільця або диска білого кольору, який є випавшим преципітатом білка.

Якщо реакція преципітації настала в першій і в третій пробірці, то це вказує на наявність крові людини.

Якщо реакція відбулася тільки у третій пробірці, а в першій - ні, то це свідчить про те, що досліджувана у першій пробірці кров не належить людині.

Якщо ж реакція відбулася в першій, третій і ще будь-якій пробірці, наприклад, четвертій або п'ятій, то це вказує на неспецифі-чність сироватки, у зв'язку з чим цю сироватку необхідно замінити.

Після з'ясування специфічності сироваток беруть ряд таких же пробірок і утворюють з них щонайменше 3 пари. В кожну першу пробірку із цих 3 пар вносять витяг із плями досліджувальної крові, а в кожну другу пробірку - витяг із предмета-носія. В першу пару пробірок додають сироватку, що преципітує білок людини, в другу пару пробірок - сироватку, що преципітує білок птиці, в третю -сироватку, що преципітує білок свині, або будь-якої іншої тварини. Наявність кільця преципітації у першій пробірці першої пари вказує на те, що це кров людини.

Таким же чином перевіряють специфічність сироваток, що преципітують білок птиці або тварин.

Отриманню позитивних результатів можуть перешкоджати низька концентрація білка у витягах (менше за 1: 1ООО), каламутність витягів, відхилення рН середовища, домішки іржі, солей заліза, міді, марганцево-кислого калію, а також властивості деяких предме-тів-носіїв, наприклад, пластмаси, гуми, клейонки, деяких сортів деревини.

В таких випадках ставлять реакцію преципітації в твердих середовищах.

б) Реакції преципітації в твердих середовищах

1. Реакція імунодифузії в агарі

При проведенні реакції використовують 1 % розчин агару, який наносять на поверхню предметного скла до утворення шару товщиною біля 0,1 см. У його товщі після застигання агара металевим пробійником роблять 3 луночки по 0,2 см в діаметрі з протилежних боків. В луночки з одного боку вносять по 2 краплі витягів з концентрацією білка 1:1000, а з іншого боку - по 1 краплі діагностичних сироваток, що преципітують білок людини та 2-3 контрольних тварин. Випробуванню піддають гі ж об'єкти, які описані були в реакції Чистовича-Уленгута. Після цього об'єкти, що розташовані на склі, витримують у вологих камерах в чашках Петрі в термостаті впродовж 24-х годин при температурі +37°С, після чого враховують результат.

Позитивним результатом вважають утворення дуг преципітату білка на кордоні між випробуваним витягом і відповідною преципі-туючою сироваткою за умови, що контрольні досліди свідчать про активність і специфічність діагностичних реагентів.

2. Метод зустрічного імупоелектрофорезу (електропреципітація)

Метод має більш високу чутливість в порівнянні з реакцією Чистовича-Уленгута, забезпечує більш корогкі терміни дослідження і рекомендується для визначення виду крові в мікрооб'єктах, при дослідженні погано розчиненої крові і каламутних витягів.

В його основі лежить здатність до міграції позитивно заряджених іонів білка випробуваної крові в електричному полі від катоду до аноду (альбуміни) і негативно заряджених іонів білків преципі-туючих сироваток (гамма глобуліни) назустріч одне одному. На межі зустрічі однойменних антигенів і преципітинів випадають преципітати білка у вигляді смуг білого кольору.

Дослідженню піддають всі ті ж об'єкти, як це було описано для попередніх реакцій, забезпечуючи дослід доказами активності і специфічності діагностичних реагентів та проводячи такі ж контрольні дослідження.

Випробовувані і контрольні витяги з концентрацією білка 1:1000 або 1:100000 вносять в луночки, зроблені в товщі застиглого агара на склі, в ряди інших луночок вносять діагностичні преципітуючі сироватки з титром 1:10000.

Для електрофорезу підготовлений агаровий блок за допомогою перехідних містків підключають до електродів, до яких подається електроживлення в режимі 42 мА при напруженні струму в межах 300-400 вольт впродовж 20-25 хвилин. Глобулінові фракції сироваток, що вміщують антитіла, рухаються від анода до катода, в той час як антигени - від катода до анода.

Позитивним результатом вважають появу преципітатів між луночкою з витягом випробуваної крові і луночкою з однойменною діагностичною преципітуючою сироваткою за умови підтвердження специфічності результату контрольними дослідами.

З. Визначення групової належності крові

Розв'язання питання про походження крові від певної особи являє собою основну задачу судово-медичної експертизи в процесі розслідування кримінальних справ, пов'язаних із вбивством, нанесенням тілесних пошкоджень, кримінальним абортом, з розслідуванням правопорушень медичного персоналу, а також під час розгляду цивільних справ за фактами спірного батьківства, материнства і замін дітей.

В основі методів визначення груп крові лежать імунологічні процеси. Об'єктами дослідження можуть бути рідка кров від живих осіб і трупів, а також кров в слідах на речових доказах.

Кров людини в судово-імунологічних відділеннях диференціюють за еритроцитарними (АВО, МNSs Резус, Келл, Кидд, Дієго, Льюїс, Лютеран, Даффі), лейкоцитарними НLA, NА, NB), тромбо-цитарними (ZW, РL), сироватковими (Gm, Нр, gc) і ферментними системами (холінестераза, кисла фосфатаза еритроцитів і ін.). У кожній з систем поєднання антигенів формують групи крови.

а) Визначення групової належності рідкої крові Іа системою АБО

Для визначення групових антигенів використовую»!» реакцію аглютинації, яка здійснюється в сольовому середовищі і при температурі, близькій до температури людською Ііла.

Зразок крові відстоюють або центрифугують, відділяючи ерит-роцитарну масу від сироватки, які потім досліджують окремо.

Антигени системи АВО виявляють за допомогою різних діагностичних реагентів, наприклад, нативних гемаглютинуючих ізоси-роваток альфа і бета, гетероімунними гемаглютинуючими сироватками анти-А, анти-В і анти-0, та пектинами або рослинними екстрактами, що містять фітантитіла анти-Н.

Реакцію аглютинації для виявлення антигенів А і В та антитіл альфа і бета здійснюють в 4-х пробірках. В перших двох пробірках досліджують 1 % еригроцитарну взвісь в ізотонічному розчині хлориду натрію, в двох інших - відділену від еритроцитів сироватку крові.

В перші дві пробірки додають діагностичні стандарті сироватки, а в дві інших - тест-еритроцити груп А і В у вигляді 1 % взвісі, які зазделегідь готують в лабораторії з крові мікродонорів. Співвідношення інгредієнтів в реакції в краплях становить 2:4.

Суміші сироваток і еритроцитів впродовж 4-х хвилин центрифугують при 1500 об./хв. або відстоюють впродовж 2-х годин, після чого мікроскопічне враховують резульїати, тобто, відмічають, в якій з пробірок настала аглютинація еритроцитів.

Аглютинація еритроцитів в перших двох пробірках вказус на присутність в них антигенів відповідно діагностичній сироватці, що була використана, а в двох інших - на присутній ь відповідних антитіл.

Група рідкої крові за системою АВО може бути визначена за допомогою Цоліклонів анти-А та анти-В.

Цоліклони анти-А і анти-В застосовують для визначення груп крові системи АВО людини, замість стандартних ізогемаглютину-ючих сироваток. Визначення груп крові системи АВО включає виявлення антигенів А і В в еритроцитах стандартними антитілами і виявлення аглютининів в сироватці або плазмі крові стандартними еритроцитами. Антигени А і В визначають за допомогою Цоліклонів анти-А і анти-В. Аглютиніни в сироватці (плазмі) виявляють за допомогою стандартних еритроцитів.

Цоліклони анти-А і анти-В є продуктом гибридомних клітинних ліній, отриманих внаслідок злиття мишачих антитілоутворюю-чих В лімфоцитів з клітками мишачої мієломи. Індивідуальні гиб-ридомні лінії продукують гомогенні антитіла тільки одного класу імуноглобулинів, які повністю ідентичні за структурою і біологічною активністю. Антитіла, що продукуються клітками одного клону (потомство однієї клітки), є моноклональними.

Моноклональні анти-А і анти-В антитіла продукуються двома різними гибридомами. Цоліклони анти-А і анти-В являють собою розведену асцитну рідину мишей-носіїв відповідної гибридоми, в якій містяться специфічні імуноглобуліни класу І М, направлені проти групоспецифічних антигенів А або В людини. Цоліклони не містять антитіл іншої специфічності і тому не викликають неспецифічної поліаглютинації еритроцитів.

Час настання реакції аглютинації і її вираженість у цоліклонів анти-А і анти-В вище, ніж у ізогемаглютинуючих АВО-сироваток, особливо у разі слабко виражених антигенів еритроцитів.

Техніка визначення груп крові

Визначення групи крові за системою АВО проводять в нативній крові з пальця, яка стабілізована консервантами або в крові, взятій без консерванту. Найбільш чітка реакція аглютинації спостерігається при використанні високої концентрації еритроцитів.

Визначення групи крові системи АВО реагентами "Цоліклон" проводять на білій фарфоровій або будь-якій іншій пластинці зі змочуваною поверхнею.

На планшет або пластинку наносять по одній краплі Цоліклонів анти-А і анти-В (0,1 мл) під відповідними написами "анти-А" або "анти-В". Поруч з краплями антитіл наносять кров, що досліджується, приблизно в 10 разів менше за краплі антитіл (0,01 мл).

Антитіла і кров змішують скляною паличкою, яку промивають і насухо витирають перед кожним розмішуванням. Спостереження за ходом реакції з Цоліклонами проводять при легкому похитуванні пластинки або планшета впродовж не більше ніж 2,5 хв.

Результат реакції в кожній краплі може бути позитивним або негативним. Позитивний результат виражається в аглютинації (склеюванні) еритроцитів. Аглютинати видні неозброєним оком у вигляді дрібних червоних агрегатів, що швидко зливаються і створюють великі аглютинати.

При негативній реакції крапля залишається рівномірно забарвленою в колір відповідного цоліклону, аглютинати в ній не виявляються. Аглютинація з цоліклонами анти-А і анти-В звичайно наступає в перші 3-5 сек.

Оцінка результатів реакції агглютинації з цоліклонами анти-А і анти-В

1. Аглютинації немає ні з цоліклоном анти-А, ні з цоліклоном анти-В. Отже, еритроцити, що досліджуються, не містять антигенів А і В, і кров належить до групи 0(1).

2. Аглютинація спостерігається тільки з цоліклоном анти-А. Отже, еритроцити, що досліджуються, містять тільки антиген А і кров належить до групи А (II).

3. Аглютинація спостерігається тільки з цоліклоном анти-В. Отже, еритроцити, що досліджуються, містять тільки антиген В, і кров належить до групи В (III).

4. Аглютинація спостерігається як з цоліклоном анти-А, так і з цоліклоном анти-В. Отже, еритроцити, що досліджуються, містять обидва антигени А і В, і кров належить до групи АВ (IV).

У всіх випадках результати повинні бути підтверджені визначенням аглютинінів в плазмі за допомогою стандартних еритроцитів.

Контроль неспецифічної аглютинації еритроцитів. Реагенти цоліклон для визначення груп крові приготовані на сольовому розчині хлористого натрію, який перешкоджає спонтанній аглютинації еритроцитів. Однак, для виключення аутоаглютинації, яка може спостерігатися у деяких хворих (мієломна хвороба, опікова хвороба), а також в пуповидній крові новонароджених, у разі позитивної реакції аглютинації еритроцитів з двома Цоліклонами анти-А і анти-В, тобто встановлення групи крові АВ (IV), необхідно провести додаткове контрольне дослідження цього зразку крові з ізотонічним розчином хлористого натрію. Для цього змішують одну велику краплю (0,1 мл) ізотонічного розчину з маленькою (0,01 мл) краплею крові, що досліджується. При відсутності аглютинації в цій контрольній краплі кров належить до групи АВ (IV).

в. Визначення групи крові в слідах сухої крові

Самим поширеним методом є метод покровного скла за Латесом. Він заснований на виявленні антитіл в кров'яних слідах за аглютинацією тест-еритроцитів груп А і В.

Реакцію проводять на предметному склі, на якому розміщують вирізані з матеріалу кров'яних слідів шматочки величиною біля 3x3 мм, вкривають їх покривним скельцем, під яке вводять по 2-3 краплі 0,25 % взвісі еритроцитів. Отримані препарати вміщують у вологі камери при температурі +4-8°С.

Результати реакції спостерігають, періодично мікроскопуючи препарати через 20-24 години. Наявність аглютинації еритроцитів вказує на присутність однойменного антитіла.

Найчастіше для визначення групи сухої крові проводять реакцію абсорбції антитіл в кількісній модифікації та реакцію абсорбції-елюції.

Реакцію абсорбції антитіл в кількісній модифікації проводять з використаням ізогемаглютинуючих сироваток. Досліджують наважки матеріалу з плямами крові та контрольні ділянки без крові по 5, 25 та 50 мг. В ці об'єкти вводять діагностичні сироватки по 0,1, 0,15 та 0,3 мл відповідно, які попередньо розводять ізотонічним розчином до титру 1:32. Впродовж 24 годин відбувається абсорбція при температурі +4°С. Після цього сироватки видаляють та досліджують їх на встановлення факту абсорбції антитіл, що досягається шляхом їх титрування в ряду пробірок з розведенням в ізотонічному розчині хлориду натрію в порядку арифметичної прогресії 1 % взвісями тест-еритроцитів груп А та В. При цьому в кожну пробірку вносять по 1 краплі відповідних тест-еритроцитів. Кількість ступенів поглинання титру антитіл сироватки, яка відображається відсутністю в кожному розведенні антитіл (абсорбція антитіл однойменним антигеном), встановлюють під мікроскопом.

Присутність антигена вважають доведеною, якщо отримують не менше 3 ступенів поглинання титра стандартної діагностичної сироватки в порівнянні з її впливом на контрольний зразок предмета-носія сліду крові.

Метод абсорбції-елюції застосовують для виявлення антигенів в слідах крові незначного розміру, коли кров має слабкі антигени та при впливі на діагностичні сироватки забруднень предмета-яо-сія сліду крові. Реакція відбувається у дві фази.

В першу фазу проходить абсорбція антитіл. До пробірок з об'єктом дослідження, яким, як правило, є декілька або одна нитка, просякнута кров'ю та зразку предмета-носія, що попередньо оброблені метанолом для фіксації слідів крові, додають по 2-3 краплі нерозведених діагностичних сироваток з титром 1:128-1:256. При цьому антигени крові абсорбують на собі антитіла сироватки. Через 24 години неабсорбовані антитіла відмивають.

В другу фазу відбувається елюція, тобто вилучення абсорбованих антитіл з комплекса атиген-антитіло, що утворився на нитці. Для цього пробірки прогрівають при температурі +50-56°С впродовж 25-30 хвилин.

Оцінку реакції проводять під мікроскопом, встановлюючи факт аглютинації тест-еритроцітів груп А та В після їх внесення до розчину антитіл. Настання аглютинації вказує на присутність відповідного антигена.

II. Судово-медична експертиза виділень

Судово-медична експертиза виділень проводиться при розслідуванні кримінальних справ, пов'язаних з статевими злочинами. Під час проведення експертизи вирішують питання про наявність сперми, видову належність та встановлення її походження від певних осіб.

Для встановлення наявності сперми на різних об'єктах-носіях використовують орієнтовні та доказові методи дослідження її слідів.

а) Встановлення наявності сперми в слідах орієнтовними методами

Орієнтовні методи допомагають експерту виявити найбільш перспективні для подальшого дослідження сліди.

Спочатку предмети оглядають візуально та встановлюють ділянки крохмальної щільності, що мають звивисті краї сіруватого кольору. Надалі їх досліджують в затемненому приміщенні в променях ртутно-кварцевого освітлювача, який є джерелом ультрафіолетових променів, виявляючи при цьому білувато-блакитні ділянки, які характерні для слідів сперми. Виявлені ділянки обшивають контрастною ниткою та проводять подальше дослідження, використовуючи орієнтовну пробу з соком бульб картоплі.

Механізм цієї реакції заснований на здатності картопляного соку, що містить аскорбінову кислоту, викликати аглютинацію еритроцитів крові людини, а в присутності сперми відбувається затримка такої аглютинації, оскільки має місце реакція між аскорбіновою кислотою картопляного соку і тестостероном сперми.

Дослідженню підлягають шматочки матеріалу вагою близьк 1 мг, які вирізані з тканини-носія сліду та екстраговані ізотонічним розчином натрію хлориду впродовж 24 годин. Як другий контрол використовують витяг з явної сперми.

По одній краплі витягів вносять в пробірки, в які додають краплині картопляного соку, заздалегідь приведеного шляхом р ведення ізотонічним розчином до титру 1:32, і по краплі 1 /о в тест-еритроцитів групи О. Суміш центрифугують 10 хвилин при 3000 об./хв. Результати враховують мікроскопічне.

Позитивним результатом (сперма?) вважають повну або часткову затримку аглютинації еритроцитів групи О під впливом випробуваного витягу і явної сперми при відсутності аглютинації під впливом предмета-носія.

Негативний результат може бути наслідком не тільки відсутності сперми в сліді, що досліджується, але бути результатом використання непридатних сортів картоплі для виготовлення соку, що заздалегідь повинно контролюватися.

До орієнтовних методів виявлення наявності сперми відносять і отримання кристалів йод-холіна з реактивом Флоранса. З підозрілої ділянки предмета-носія сліду сперми вирізають невеликий шматочок тканини приблизно 0,3x0,3 см, розміщують його на предметному склі та додають 3-4 краплі реактиву Флоранса. Через 2-5 хвилини утворюються кристали йод-холіну, які мають світло-коричневий колір та подовжену форму з розщепленими кінцями, які нагадують хвіст ластівки. Такі кристали можуть утворитися з любою речовиною, в якій наявний холін.

6) Доказові методи визначення наявності сперми

Ці методи дозволяють виявити морфологічні та біохімічні складові, що утворюють сперму.

Основним методом є морфологічне дослідження на предмет виявлення елемента сперми - сперматозоїда.

Дослідженню підлягають безпосередньо вирізані з матеріалу плями, нитки або витяги після екстрагування матеріалу плями в слабому розчині водяного аміаку (5-10 %) Після екстрагування витяг наносять на предметне скло і мазок обробляють барвниками. Для забарвлення переважніше застосовувати не оглядові фарби (соляно-кислий фуксин, еритрозин, метиленова синь), а такі, які ефективно забарвлюють цитоплазму і ядро голівки сперматозоїда. Такий спосіб забарвлення дозволяє стверджувати наявність сперми вже по виявленні ізольованих голівок сперматозоїда, позбавляє від помилок у разі присутності в полях зору мікробних тіл, які за величиною і формою схожі з голівками сперматозоїдів, оброблених тільки оглядовими барвниками.

Мікроскопічне дослідження препаратів сперми проводять з використанням медичних мікроскопів із збільшенням 10x40.

До доказових методів встановлення наявності сперми відносять виявлення кислої фосфатази, холіну та сперміну, ізоферменту лактатдегідрогенази-Х, білку "протеїн-30", у-семінопротеїну, широкої фракції альбумінів при електрофорезі, хімічного елементу цинку.

У випадку азооспермії або олігоспермії доказовим методом діагностики сперми може бути тонкошарова хроматографія з обов'язковим виділенням фракцій холіну та сперміну, кислої фосфатази.

Вирішуючи питання про видову належність сперми, враховують морфологію сперматозоїда та результати реакції преципітації Чистовича-Уленгута.

При вирішенні питання про походження сперми від конкретної людини встановлюють групову належність сперми, попередньо з'ясовуючи категорію видільництва. Якщо людина відноситься до категорії видільників, то у неї, як в крові, так і виділеннях, за допомогою відповідних методів виявляють антигени системи АВО. У разі невидільництва в виділеннях такої людини антигени не вдається виявити зовсім, або вони досить слабкі і можуть бути виявлені тільки більш чутливими методами дослідження.

У разі виявлення в слідах сперми на речових доказах певних антигенів і визнанні підозрюваного чоловіка невидільником, в розв'язанні питання про походження сперми від такої особи враховують не тільки збіг антигенної структури, але і категорію видільництва.

III. Особливості експертизи волосся

При обговоренні методів проведення експертизи волосся, передусім, обговорюють судово-медичне значення волосся в експертизах, пов'язаних з розслідуванням кримінальних справ за фактами вбивств, нанесення тілесних пошкоджень, за фактами статевих злочинів тощо.

Розглядають також коло обов'язкових для вирішення питань і межі компетенції судово-медичного експерта.

На занятті студенти самостійно готують препарати з власного волосся для дослідження його структури та диференціації випадного чи вирваного, забарвленого чи незабарвленого волосся. Для порівняння студенти готують препарати з хутра різних тварин.

Для приготування препарату з волосся або хутра необхідно досліджуєме волосся розмістити на предметному склі, обробити його краплею ксилолу і покрити покривним скельцем, після чого розглядати під мікроскопом.

Крім того студенти проводять мікроскопічне дослідження препаратів з колекції волосся, що є на кафедрі, знайомляться з описом ознак і особливостей мікроструктури волосся, вивчаючи не тільки препарати, але й мікрофотографії, малюнки і таблиці.

Студенти визначають ті ознаки в структурі волосся і ті особливості, які кладуть в основу розв'язання питання диференціації волосся людини і волосся тварини, волосся людини з голови і регіональних ділянок тіла, волосся і текстильних волокон, рослинних волокон, а також питань про механізм відділення волосся, про характер травмуючих знарядь, про зміну волосся від механічних і термічних чинників, про факти штучного його забарвлення тощо.

IV. Геномна дактилоскопія

Останнім часом для встановлення індивідуальної належності об'єктів біологічного походження використовують геномну дактилоскопію (генотипоскопічну експертизу), в основі якої лежить структура ДНК.

Різниця між індивідуумами пов'язана з неоднаковою повторюваністю послідовностей нуклеотидів в кожному гіперваріабельно-му локусі ДНК. Спектр розподілення повторів за довжиною є унікальним для кожного індивідуума.

Найбільш перспективним та ефективним методом аналізу ДНК в судово-медичних цілях являється полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Це метод ферментативної ампліфікації ДНК іп УІІГО, який дозволяє впродовж годин розмножити необхідну ділянку ДНК.

Для ПЛР не потрібно як значної кількості ДНК, так і високого рівня очистки ДНК, що значно спрощує процес та його тривалість.

Суть методу полягає в тому, що два олігонуклеотидних прайме-ри (затравка) фланкують обрану ділянку ДНК; фермент ДНК-полі-мераза здійснює синтез (добудову взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з праймерів та використовуючи дезоксири-бонуклеозидтрифосфати. Кожна з молекул ДНК, що синтезовна за допомогою одного з праймерів, є матрицею для синтезу комплементарної ДНК за допомогою іншого праймера.

В якості праймера використовують олігонуклеотіди довжиною 8-20 нуклеотидів, які комплементарні до матричної ДНК. Праймери орієнтовані таким чином, що локальний синтез ДНК проходить в її межах.

ПЛР з праймерами, що фланкують відому послідовність ДНК, використовують для аналізу мінливості окремих локусів ДНК. В криміналістичних дослідженнях добирають праймери, що фланкують локуси з гіперваріабельними послідовностями. При цьому необхідна інформація про послідовності, які досліджують. Ідентифікацію алелей розподілення продуктів реакції за певним локусом здійснюють у поліакриламідному гелі з наступною візуалізацією, використовуючи забарвлення.

Геномну дактилоскопію застосовують для визначення індивідуальної приналежності крові, сперми, волосся та ідентифікації особи. При цьому необхідно мати відповідну базу порівняння. Важливим є той факт, що ДНК може бути виділена з різних тканин, навіть тих об'єктів, що мають декілька клітин. Можна також дослідити і сильно деградовану ДНК.

Джерела, рекомендовані до заняття:

Date: 2015-07-02; view: 554; Нарушение авторских прав