Лабораторна робота 3. «кількісне визначення антитіл методом локального гемолізу в гелі»

(4 години)

«Кількісне визначення антитіл методом локального гемолізу в гелі»

Мета роботи: навчитися визначати концентрацію IgG, IgM i IgA в сироватці крові людини; навчитися будувати калібрувальну криву для визначення концентрації імуноглобулінів.

План:

1. Антитіла та їх молекулярна структура. Антигенні властивості антитіл.

2. Просторова структура важких і легких ланцюгів і організація четвертинної структури антитіл. Доменна будова імуноглобулінів.

3. Активний центр антитіл та його організація. Імуноглобуліни та їх секреція. Катаболізм імуноглобулінів.

4. Біосинтез молекул імуноглобулінів. Теорії утворення антитіл. Антитіла класів M, G, A, D, E.

5. Моноклональні антитіла.

6. Механізми зв’язування антигенів з антитілами. Значення компліментарності паратопа і епітопа. Афінність. Авідність.

7. Антиген як функціональний термін. Джерела і хімічна природа антигенів.

8. Специфічність і імуногенність. Фактори, що визначають антигенний потенціал і його реалізацію.

9. Антигени, гаптени, носії та їх хімічна природа.

10. Тимусзалежні та тимуснезалежні антигени.

Матеріали та обладнання: стандартна сироватка крові людини з відомими концентрацiями IgG, IgM і IgA (антигени); моноспецифічні антисироватки; тестовані сироватки крові людини; 2,5%-й агap на фізіологічному розчині; волога камера; вимірювальний інструмент з точність до 0,1 мм; піпетка або шприц, що дозволяють дозувати об’єми від 1 до 10 мкл; пробійник з внутрішнім діаметром 2 мм для формування лунок в агарі.

Самостійна робота студентів:

1. Готують розчини антисироваток, що знаходяться в ліофілізованому станi в ампулах (робочі титри вказані на ампулі, наприклад 1:20). Необхідно приготувати половинні розведення антисироваток на фізіологічному розчині (наприклад 1:10), оскільки надалі вони зливатимуться в співвідношенні 1:1 з розплавленим агаром і їх кінцевий титр відповідатиме вказаному на ампулі.

2. Розплавляють 3%-й агар на фізіологічному розчині і колбу з агаром поміщають у водяну баню за 50°C.

3. Підігрівають чашку Петрі, піпетки (у термостаті за температури 37°С), щоб шар агару з антисироваткою рівномірно розподілився по поверхні скла. Антисироватку з половинним титром також нагрівають до 50°C.

4. Приготувати камеру (чашку Петрі) для заливання агару. Камеру підігріти до 57°С. На камеру нанести помітку відповідного класу імуноглобулінів.

5. В хімічну пробірку внести 6 мл фіз. розчину, попередньо нагрітого на водяній бані до 56°С, до нього додати 1 мл розведеної антисироватки одного з класів імуноглобулінів і з’єднати з 7 мл агару, нагрітого до 56°С. Суміш акуратно залити в камеру. Суміш застигає упродовж 10 хв. Процедуру повторити для всіх класів імуноглобулінів.

5. У товщі агару пробійником вирізають лунки діаметром 2 мм на відстані 15 мм одна від одної. На склі роблять декілька рядів лунок. У лунки одного ряду вносять за допомогою мікрощприца 2 мкл нерозведеної стандартної сироватки (контрольна сироватка з відомою концентрацією імуноглобулінів), а також її розведення 1: 2; 1:4; 1:8, 1:16 (Рис. 4.2). Лунки іншого ряду заповнюють досліджуваними сироватками (тобто тими, в яких необхідно визначити концентрацію імуноглобулінів)

6. Чашки Петрі інкубують у вологій камері упродовж 24 годин (для Ig M – 48 год). Після закінчення інкубації вимірюють діаметри кілець преципітації вимірювальним приладом (бінокулярна лупа, окулярний мікрометр, лінійка, лупа) та за калібрувальною кривою визначають кількість імуноглобулінів у досліджуваній сироватці.

7. Провести фарбування мазків крові (лаб. роб. №3): мазки фіксують метанолом 1 – 2 хв; потім нанести фарбу Романовського-Гімзе на 15 – 17 хв, змити у дист. воді. Промікроскопіювати з імерсією (´90): визначити відсоток Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та О-клітин.

8. Провести фарбування мазків крові (Лаб. роб. №2):

Спосіб №1. На мазок крові наносять фарбу-фіксатор Мая-Грюнвальда на 3 хв; фарбу змивають дистильованою водою; потім на мазок наносять розведену фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2) на 20 хв; мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

Спосіб №2. На мазок крові наносять етиловий спирт на 20 – 25 хв до випаровування фіксатора; зафіксовані мазки забарвлюють упродовж 20 хв фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2); мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

9. Підрахувати формені елементи крові у мазках за допомогою світлового мікроскопу (´90) з імерсією: визначити відсоток лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів (закінчення Лаб. роботи №2).

10. Порівняти одержані значення кількості клітин зі значення нормальних показників крові здорової людини або тварин.

10.1. Показники складу крові щурів:

Таблиця 3.1.