З. Другие методы исследования

1. Непрямая иммунофлюоресценция — метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем — в присутствии меченных флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

2. Методы, основанные на реакции агглютинации. Для реакции агглютинации обычно используют эритроциты (гемагглютинация) или частицы латекса (латекс-агглютинация), покрытые известным антигеном. В присутствии антител к этому антигену происходит агглютинация эритроцитов или частиц латекса. Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антигенам, латекс-агглютинация — для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем РИА и твердофазный ИФА.

II. Определение поверхностных антигенов лимфоцитов — CD (см. табл. 18.8) — широко применяется при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике гемобластозов, иммунодефицитов и других заболеваний, обусловленных нарушением иммунитета, а также для контроля за приживлением трансплантата и эффективностью иммунотерапии. В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.

А. Моноклональные антитела вырабатываются гибридомами, которые образуются при слиянии миеломных клеток с нормальными плазматическими клетками. Для фенотипирования лимфоцитов человека используют мышиные моноклональные антитела. Моноклональные антитела используются не только для выявления разных типов клеток, но и для изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов.

Б. Флюорохромы — это вещества, которые поглощают падающий свет определенной длины волны и излучают поглощенную энергию в виде света большей длины волны. В большинстве случаев антитела метят флюоресцеина изотиоцианатом или фикоэритрином. Оба вещества флюоресцируют под действием света с длиной волны 488 нм, при этом флюоресцеина изотиоцианат излучает зеленый, а фикоэритрин — оранжевый свет. Новый флюорохром — перидинин — также флюоресцирует под действием света с длиной волны 488 нм, но излучает красный свет. Использование трех флюорохромов, поглощающих возбуждающий свет одной длины волны, позволяет одновременно определять три разных поверхностных антигена. Другие флюорохромы, например техасский красный, родамин, аллофикоцианин, применяются лишь с исследовательской целью.

В. Проточный цитофлюориметр — прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки: размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла.

Г. В большинстве клинических лабораторий для определения поверхностных антигенов лимфоцитов используют цельную кровь. Суть метода заключается в следующем: 1) к небольшому объему цельной крови добавляют меченные флюорохромом моноклональные антитела; 2) после инкубации, необходимой для связывания антител с антигенами клеточной поверхности, разрушают эритроциты; 3) с помощью проточного цитофлюориметра анализируют клеточный состав пробы.

Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (T-, B- и NK-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют T-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитов CD4/CD8 превышает 1, как правило, оно составляет 1,5—2, остальные 30% приходятся на B- и NK-лимфоциты. В клинических лабораториях проточная цитофлюориметрия широко применяется для определения содержания лимфоцитов CD4 при ВИЧ-инфекции. Проточная цитофлюориметрия становится стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов. Результаты проточной цитофлюориметрии, как правило, не позволяют поставить диагноз, но дают важную информацию для его уточнения.