Бактериологическая диагностика бруцеллеза

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков из патологического

материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование.

Из доставленного на исследование патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка,

жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек.

Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные на пламени, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин (см.

Приложение N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие,

грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно кокко-бактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование.

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозно- глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар (см. Приложение N 1, п. 2).

Культивирование возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-аминопептидном агарах, а также на сывороточно-декстрозном агаре (см. Приложение N 1, п. 2).

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии

протирают тампонами, смоченными 5-процентным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печенки и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 - 0,2 мл высевают на поверхность предварительно

подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из органов (место прокола органа предварительно прижигают

раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10

пробирок агара. При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и

стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений). Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3-процентным раствором гидроокиси калия на 30 минут. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала

суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5- процентного спиртового раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 мл среды.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 - 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 - 0,2 мл вносят на 3 - 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 - 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек инкубируют в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 - 15%), другую - в обычных атмосферных условиях.

Для выделения возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) все посевы инкубируют в атмосфере, содержащей 10 - 15% углекислого газа.

Для создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа засеянные пробирки заливают парафином или помещают в эксикатор (микроанаэростат).

Перед парафинированием пробирки закрывают горящими ватными пробками, пронося

последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 - 1 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25-процентного раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл

концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический

метод (см. Приложение N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 - 38 °С в течение 30 дней. Первый просмотр посевов проводят через 18 - 24 часа. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, отбраковывают.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 - 4 дня

визуально, при необходимости через лупу или при малом увеличении микроскопа. При отсутствии

роста часть поверхности агара орошают конденсационной жидкостью.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок)

бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара

бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью

просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем -

сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с

появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо,

возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В

отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой

пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов и делают пересев на

чашку с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же,

как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним

из специальных методов), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на

стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой.

При постановке реакции агглютинации на обезжиренное предметное стекло наносят каплю

бруцеллезной сыворотки в разведении 1:50 и каплю той же сыворотки в разведении 1:2 (для

выявления слабоагглютинабельных культур). В каждую каплю сыворотки бактериологической петлей

вносят агаровую культуру и тщательно растирают ее. Одновременно ставят контроль с негативной

сывороткой в тех же разведениях.

При положительной реакции через 1 - 3 мин. в капле позитивной сыворотки образуются хлопья

или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В

контроле наблюдается равномерное помутнение без образования хлопьев.

При отрицательной реакции агглютинации с культурой из одной колонии дополнительно

исследуют не менее трех-четырех подозрительных колоний.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и

культуральными свойствами и дающие положительную реакцию агглютинации с позитивной

сывороткой, относят к бруцеллам.

Первичные культуры возбудителя инфекционного эпидидимита баранов подвергают

серологической идентификации. Для этого проводят гипериммунизацию двух кроликов массой 2 - 3

кг путем двукратного с интервалом 7 - 8 дней внутривенного введения им по 2 мл взвеси

двухсуточной исследуемой культуры, содержащей 3 - 4 млрд. микробных клеток в 1 мл

физиологического раствора. Через 10 - 12 дней после второго введения от кроликов получают

сыворотку крови и исследуют ее в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с овисным

антигеном.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов вызывает образование антител в

крови кроликов (положительная РДСК). Отрицательный результат РДСК с овисным антигеном

означает, что изучаемая культура не относится к возбудителю инфекционного эпидидимита баранов.

3.5. Биологическое исследование.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 -

400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием сыворотки их крови в РА с

отрицательным результатом в разведении 1:5.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для

бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном

физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят подкожно с внутренней стороны бедра

морской свинке в дозе 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек (предварительно обработанных тампонами, смоченными

дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами) вырезают кусочки

размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют их на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком

и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской

свинке в дозе 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в дозе 0,2 - 0,3 мл. При этом

необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно

стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2

- 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15-й, 25-й и 40-й дни после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 - 2

мл из ушной вены путем надреза или из сердца - путем пункции и сыворотку крови исследуют в

пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации (в разведении 1:10 и выше) морских свинок

убивают, в случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют

бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в 1 пробирку бульона и 2 пробирки

агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева),

печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают

отрицательной, подопытных животных убивают.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала

биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок

убивают.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры

возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови

1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах

бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез.

3.7. Сроки исследования:

бактериологического - до 1 месяца;

биологического - до 2 месяцев.

3.8. В районных и межрайонных ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атмосферах в

течение 1 часа.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл, а также в целях дифференциации полевых

штаммов от вакцинных выделенные от животных культуры направляют в республиканские,

областные, зональные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские

учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза

животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй

группы.