Определение содержания глюкозы глюкозооксидазным методом

Принцип. Глюкоза окисляется в присутствии глюкозооксидазы согласно реакции: Глюкоза + О₂ → глюконолактон + Н₂О₂. Образующаяся перекись водорода под действием пероксидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта: о-Дианизидин + Н₂О₂ → о-Дианизидин (ОКИСЛЕННЫЙ) + Н₂О. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы (по наборам НТПК «Анализ-Х», Белоруссия).

1. Буферный раствор, рН=6,0, 2х200 мл.

2. Реагент (смесь ферментов), 2х0,2 г.

3. Депротеинизирующий реактив (концентрат 30% ТХУ), 10 мл.

4. Стандарт глюкозы 5,55 моль/л, 2,0 мл.

5. Стандарт глюкозы 16,0 ммоль/л, 2,0 мл.

Набор рассчитан на 400 определений при расходе 1 мл рабочего реагента, или 200 определений при расходе 2 мл. Линейная область: 2-27 ммоль/л.

Приготовление рабочего реагента. За час до проведения анализа содержимое флакона 2 растворяют буферным раствором из флакона 1. Рабочий реагент хранится в темном месте при температуре 2-8^оС в течение недели.

Определение концентрации глюкозы в плазме, сыворотке крови и моче. Мочу перед анализом разводят дист. водой в отношении 1:5 или 1:10, в зависимости от оказания качественной реакции, и результат умножают на коэффициент разведения. Компоненты в реакционной смеси отбирают в количествах согласно данным таблицы:

Ход определения

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 15 мин при 37^оС.

Измеряют оптическую плотность опытной пробы А_оп и стандартной пробы А_ст против холостой пробы при длине волны 510 нм (сине-зеленый светофильтр), в кювете с рабочей шириной 10 мм.

Расчет концентрации глюкозы производят по формуле:

А_оп где С_оп – концентрация в опытной пробе (моль/л),
С_оп= · С_ст А_оп – оптическая плотность опыта,
А_ст А_ст - оптическая плотность стандарта,
С_ст - концентрация стандарта (5,55 ммоль/л).

Определение глюкозы в цельной крови. Цельную кровь депротеинизируют 3% раствором ТХУ. Глюкозу определяют в надосадочной жидкости после центрифугирования. Объемы компонентов приведены в таблице:

Пробу перемешивают и центрифугируют 10 мин при 1500 об./мин.

Далее измерение проводят так же, как при анализе без депротеинирования. Расчет концентрации глюкозы производят по указанной выше формуле. В случаях, когда оптическая плотность опытной пробы превышает 0,85, образец разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, а полученный результат умножают на 2.

Нормальные величины:
Сыворотка (плазма): 4,2-6,1 ммоль/л.

В ходе выполнения аналитических исследований осуществляется контроль качества.