Методи зараження лабораторних тварин.

- інтраназальне(введення шприцом чи піпеткою пастера в кожну ніздрю тварини вірусовмісного матеріалу, або введення спеціального зонду з вірусвмісним матеріалом в дихальні шляхи, трахею, або бронхи. Інша різновидність методу – це інгаляція матеріалу).

- інтраплевральне зараження(метод інфікування лабораторних тварин в плевру)

- через травний тракт(зараження здійснюється трьома шляхами. А – оральний спосіб. Б – безпосередньо в шлунок. В – ректальне зараження)

- перкутанне зараження(матеріал втирається в неушкоджену депільовану шкіру стерильним інструментом)

- кутанне зараження(здійснюється методом скарифікації)

- субкутанне зараження(це метод підшкірного інфікування)

- інтракутанне зараження(зараження в шкіру, під шар епідермісу)

- ітравенозне та інтракардіальне зараження(вірусовмісний матеріал вводять у вени або безпосередньо у серце)

- інтрамускулярне зараження(вірусовмісний матеріал вводять у м’яз тварини)

- інтраперитоніальний(вприскування матеріалу у черевну порожнину)

- субокципітальне

- інтраспінальне(зараження в спинний мозок)

- інтрацеребральне зараження(зараження в головний мозок)

- зараження в периферичний нерв

- інтратестикулярне зараження(введення матеріалу в сім’яники тварин)

- інтраокулярне зараження(інфікування в передню камеру ока)

- кореальне зараження(інфікування в очне яблуко)

- інтракорнеальне зараження(зараження в рогівку)

-кон’юнктивальне зараження(зараження в оболонку ока)

20. Поняття про тропізм вірусу(приклади)

Тропізм – здатність вірусу реплікуватися в певних типах клітин організму. Віруси що репродукуються у нервових клітинах називаються нейротропними(вірус сказу, віруси герпесу). У клітинах шкіри – дермотропними(віруси віспи, вісповакцини, герпесу). У клітинах легень та дихальних шляхів – пневмотропними(віруси грипу, парагрипу, аденовіруси, риновіруси). В клітинах кишково-шлункового тракту – ентеротропними(Ентеровіруси, вірус гепатиту А). Віруси які здатні реплікуватися в декількох типах клітин, називаються політропними, а в усіх типах клітин – пантропними(вірус чуми собак, вірус поліомієліту).

21. Кількісна оцінка інфекціі при застосуванні лабораторних тварин

LD50 - доза вірусу, при якій гине половина (50%) тварин контрольної групи (LD = "lethal dose").

ID50 - доза вірусу, при якій виникають симптоми інфекції у половини (50%) тварин контрольної

групи (ІD = “infection dose").

22. Приклади використання лабораторних тварин для діагностики вірусу.

Наприклад для діагностики вірусу грипу:

- Тхорі (уражуються верхні і нижні дихальні шляхи, клінічна картина найближча до такої у людини)

Проблеми: сприйнятливість до інших вірусів (напр. чуми собак), висока вартість, низька ефективність

- Білі щурі (переносять інфекцію в субклінічній, інапарантній формі, висока концентрація вірусу і висока вірулентність для мишей)

Проблеми: інапарантіна форма інфекції

- Білі миші ((висока сприйнятливість до вірусів від тхорів та щурів)

Проблеми: неможливість використання для виділення вірусу від хворої людини

23. Типи культур клітин

1. Органна культура(зберігає міжклітинні взаємодії а також гістологічне та біохімічне диференціювання. Нездатні до розмноження)

2. Клітинна культура(позбавлені структурної організації, але здатні до розмноження)

А- переживаючі(проліферація обмежена)

А1 – ті що культивуються в рідкому середовищі

А2 – ті що культивуються на твердому середовищі

Б – ростучі(високий рівень проліферації)

Б1 – культури фіксованих шматочків клітин(1- капельно-плазменні культури, 2- культури що вирощуються в флаконах Карвеля, 3- культури у нерухомих пробірках, 4- культури у пробірках що обертаються)

Б2 – одношарові(1- первинні (первино-трипсинізовані) – походять від клітин та органів, взятих безпосередньо із організму, живуть ≈ 2 тижні, діляться 5-10 разів, залишаються диплоїдними (нирка ембріона людини, куринні фібробласти, нирка макаки-резус);, 2-напівперевивні(напівперевивні (напівперещеплювальні) – живуть ≈ 80 міс, до 100 поділів, більшість залишається диплоїдними ≈ 75%, не мають онкогенної активності (WIT38-фібробласти легень людини, ТМ4 – лінія епітеліальних клітин миші);

3- перещеплювані (перевивні) – нескінчена кількість мітозів, змінюється диплоїдний на поліплоїдний набір хромосом. Переваги: однаковий тип клітин, проста техніка культивування, можливе використання певних штамів в лабораторних умовах, вищо швидкість розмноження, більш широкий спектр чутливості до вірусу (HeLa, Hep-2, KB).

Б3 - суспензійні

24. Переваги і недоліки використання лабораторних тварин для діагостики вірусів

Недоліки:

-Утримання тварин протягом експерименту є відносно дорогим

-Тварини більш трудомісткі в роботі, завдають багато клопоту з утримання

- При експериментах на тваринах не так швидко одержуються результати дослідів

- Існує небезпека інфікування обслуговуючого персоналу та створення аварійних ситуацій

- Незнання епізоотичного минулого тварин, які залучаються до експерименту, наявність безсимптомних інфекцій може призвести до зменшення або навіть зникнення чутливості до досліджуваного вірусу, тобто до резистентності. Можливе виникнення явища синергізму в дії двох вірусів (прихованого і досліджуваного), що іноді дає результати, які важко інтерпретувати.

Переваги:

- В багатьох видах лабораторних досліджень тваринивідіграють головну роль: для вірусу гепатиту В використовуються примати, оскільки для нього невідомі приклади реплікації в організмах інших тварин і в КК, при вивченні онкогенних вірусів використовуються хомячки, бо вони є високочутливими до цих вірусів, які легко викликають у тварини пухлини у цих модельних обєктів, що дозволяє отримати відповідні антистроватки.

- Експерименти по вивченню механізмів патогенезу та ролі імуної відповіді можуть бути проведені лише на лабораторних тваринах

- Лабораторні тварини інтенсивно використовуються для отримання діагностичних антисироваток.

- Використання для дослідження вірусів які не можна дослідити на культурах клітин або курячих ембріонах

- Вивчення імунної відповіді

- Можуть слугувати як індикатор вільного вірусу

- Використання для титрування вірусів

- Можливість оцінки лікувальних препаратів

- Можливість вивчення прояву вірусних інфекцій на всіх стадіях хвороби

25. Переваги та недоліки використання курячих ембріонів

Ембріональні тканини з великою кількістю клітин, шо швидко ділять­ся, з високим обміном речовин є дуже сприятливим середовищем для куль­тивування вірусів. Особливо це стосується оболонок ембріону, які багаті клітинами зародкового епітелію. Суттєву роль для розмноження вірусів відіграє жовткова оболонка, шо оточує жовток. Він є органом живлення і під час розвитку поступово зменшується. У період з 5-го по 12-й день інку­бації курячі ембріони можуть бути використані для ураження вірусами. Ураження в ту чи іншу частини ембріону проводяться в період її макси­мального розвитку, коли кількість чутливих клітин найбільша.

Переваги:

-антибактеріальне середовище;

-велика кількість вірусу, яку можна отримати;

-висока життєздатність та стійкість до зовнішніх факторів;

-відсутнє антитілоутворення;

-виявляють чіткі симптоми розвитку інфекції;

-це проста і дешева модельна система.

Недоліки:

- неможливість вивчення патогенезу

- неможливість отримання вакцин і сироваток

-високий рівень неспецифічного білку у екстра ембріональних вірусних рідинах;

-можливість спонтанного інфікування деякими вірусами;

-ймовірність латентних вірусних інфекцій (дуже рідко).

26.Переваги та недоліки використання культури клітин

Переваги

1.висока однорідність

2.можливість підтримки клітин у лаг-фазі

3. Можливість моделювання клітинного росту в залежності від умов зовнішнього середовища

4. Можливість багаторазового дослідження змін фізіології клітин у суспензії.

5. здатність до необмеженого розмноження;

6.простота отримання;

7.можливість попередньої перевірки на присутність латентної вірусної інфекції;

8.забезпечення стандартних умов для розмноження вірусів, в порівнянні з первинними КК (що являють собою популяцію змішаних типів клітин);

9. широкий спектр чутливості до вірусів, в порівнянні з відповідними первинними КК.

Недоліки

1.Довгий період (до 4 тижнів) до результату.

2.Залежність зараження від кондиції культури.

3.Чутливість до контамінації та токсинів.

4.Багато вірусів не культивуються, напр. гепатит B, вірус діарреї, парвовіруси, папіломавіруси.

5.схильність до злоякісного перетворення;

6.швидке зниження чутливості до вірусів, у порівнянні з первинними КК.

27. Використання рослин для ідентифікації вірусів.

Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус. Як індикатори у фітовірусології найчастіше використовують рослини таких родин

28. Симптоми вірусних інфекцій на рослинах- індикаторах.

Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус. Залежно від реакції даної рослини на певний вірус виділяють системні і локальні симптоми. Локальні симптоми виникають при гіперчутливій реакції рослини на даний вірус – в місці враження вірусом відбувається активна реакція, що супроводжується некрозом і мертві клітини блокують подальше розповсюдження вірусу у рослинному організмі. До таких реакцій належать:

1. Хлоротичні місцеві враження – при руйнуванні хлорофілу певна ділянка знебарвлюється.,

2. Некрози – відмирання клітин.,

3. Кільцеві плямистості

При системному ураженні рослини вірус циркулює по всьому її організму, викликаючи симптомний прояв в цілих системах. Наприклад:

1. На листках:

- зміна забарвлення всієї пластини

- її деформація

- мозаїки(міжжилкова, прижилкова)

- затримка росту

2. На стеблах:

- деформація крони

- сплющеність гілок

- розтріскування і ямчатість кори

- нарости

3. На квітках – пігментоване забарвлення квіток, пов’язане зі зміною кількості антоціанів.,

4. На плодах:

- нерівномірне забарвлення

- некрози

- деформація

Фаготипування.

Фаготипування:

• (фаго- + типування) – визначення приналежності виділеного бактеріального штаму до того чи іншого фаготипу; застосовується, як правило, в інтересах епідеміологічного анализу.

• Фаготипування - високоспецифічний процесс. У випадках, наприклад, внутрішньолікарняних інфекцій, метод може точно вказати на носія патогенного штаму (один и той же фаговар).

30. Застосування світлової мікроскопії для діагностики вірусів

Оскільки вірусні частки є занадто маленькими і роздільна здатність світлового мікроскопа є недостатньою для того, щоб їх побачити(роздивитись можна лише вірус віспи і так звані мінівіруси), віруси діагностують за видозмінами клітин під їх впливом. Під світловим мікроскопом розглядають культури клітин, попередньо заражені вірусом і визначають віруси за специфічними видозмінами, які вони спричинюють – цитопатичним ефектом, наявністю внутрішньоклітинних включень, дезінтеграцією ядер. Мінусом цього методу є те, що далеко не всі віруси здатні спричинювати цитопатичну дію, наприклад вірус гепатиту Б, ніяк не впливає на культури клітин. Серед реакцій клітини на вірус розрізняють:

1. Неспецифічні, що підходять лише для підтвердження його наявності чи відсутності в клітині

2. Специфічн, за якими можна провести ідентифікацію вірусу.,

3. Утворення тілець включень, які можуть бути

А – фабриками вірусів(наприклад тільця Гван’єрі можна виявити в клітині при зараженні її віспою)

Б – продуктами реакції на вірусну інфекцію

Існує класифікація цитопатичної дії за Арджапарідзе, за якою ідентифікують наприклад вірус герпесу, кору, віспи, аденовіруси і т.д.

31. Застосування люмінесцентної мікроскопії для діагностики вірусів

Суть методу полягає у вторинно-наведеній флюоресценції біологічних об’єктів при обробці їх розчинами різних флюорохромів. При цьому препарати для мікроскопії готують з клітин інфікованого листя(для фітовірусів), клітин ссавців, комах і т.д. Після відповідної фіксації і промивки зразки обробляють флуоресцентними барвниками(акрединовим оранжевим). Зазвичай беруть водний розчин цих барвників дуже низької концентрації, щоб не пошкодити клітину. Після підготовки зразки досліджують при різних інструментальних збільшеннях, з відповідними світлофільтрами(зазвичай пропускають УФ – діапазон спектра).

Переваги цього методу:

1. Поєднує кольорове зображення з контрасністю

2. Можна вивчати локалізацію вірусу в клітині, вибірково зв’язуючі його з різними флюорохромами.

3. Можна визначати функціонально – морфологічні зміни клітин під впливом віруса

4. Можна вивчати живі інфіковані клітини в середовищі

32. Застосування електронної мікроскопії для діагностики вірусів

У зв'язку з дуже маленькими розмірами вірусних часток їх практично неможливо роздивитися за допомогою світлового мікроскопа(крім віспи і мінівірусів) – його роздільної здатності для цього недостатньо. Саме тому, лише з винайденням електронного мікроскопу стало можливим вивчати морфологію віріонів, адже його роздільна здатність досягає 4-5 анстрем. Діагностика вірусів за допомогою ЕМ базується на ідентифікації вірусів за їх характерною морфологією. Головна перевага діагностики за допомогою ЕМ – можливість візуалізувати вірус. Можливо ідентифікувати вірус безпосередньо без попереднього вивчення вірусного агента. Інша перевага методу – це швідкість діагностики. Препарат може бути розглянутим протягом декількох хвилин після приготування препарату з вірусвмісної рідини. Головний недолік – неможливість дослідити багато матеріалу, також для вичвлення повина бути певна концентрація вірусних часток. Деякі віруси (вірус саркоми Рауса) мають нечітку морфологію, що робить їх детекцію дуже складною.(см. № 35)

33. Принцип дії електронного мікроскопу

У вакуумній камері розміщені катод і анод. Під впливом різниці напруг між ними відбувається емісія електронів з катоду(V – подібна вольфрамова нитка), вони прямують до анода(металева пластинка з отвором) – та їх частина, яка пройде через отвір анода, і створює електронний промінь. Вакуум створюється спеціальними насосами, для того, щоб молекули газів не гальмували електрони. Далі електронний промінь проходить конденсорну лінзу, і прямує до препарату. При проходженні через нього частина електронів розсіюється, частина поглинається а решта проходить наскрізь. Ті електрони що пройшли наскрізь утворюють зображення, яке збирає об’єктивна, і збільшує проектуюча магнітні лінзи. Електрони, проходячи через речовину обєкту, змінюють свої траєкторії – розсіюються. Число розсіяних електронів збільшується зі збільшенням густини досліджуваної речовини, її атомного номера, товщини зразку та зменшенням енергії електронів. Щоб затримувати електрони природнім об’єктам потрібне контрастування, при якому певні їх структури зв’язуються з атомами важких металів, і набувають здатності не пропускати електрони. В цьому місці на зображенні буде темна область. Це позитивне контрастування. Значно частіше у вірусології застосовують негативне – коли контрастують фон, а не сам об’єкт.

Далі електрони попдають на люмінесцентний екран. Вони передають йому свою енергію, після чого молекули екрану будуть випромінювати її у вигляді світіння. В іншому випадку зображення передається на фотопластинку. Практично неконтрастовані частки невеликих вірусів, розташовані на підтримуючій плівці, спостерігаються в ЕМ в вигляді безструктурних плям, тому біологічні обєкти необхідно контрастувати.

Для ЕМ характерна велика ймовірність виникнення артефактів. Це повязано з процесом фіксації та висушування, а також з процесом контрастування.

34. Переваги та недоліки використання курячих ембріонів для діагностики вірусів.

См. № 25

35. Переваги і недоліки використання електронної мікроскопії для діагностики вірусів.

Переваги

1. Можливість візуалізації вірусу

2. Можливість ідентифікування вірусу без попереднього вивчення

3. Швидкість діагностики

4. Можливість вивчення візуально вірусу на будь-яких стадіях

Недоліки

1. неможливість дослідити одночасно багато матеріалу

2. Повинна бути низька концентрація вірусних часток

3. Складність та дороговизна утримання і використання

4. Спеціальні умови

5. Низька чутливість

36 .3астосування атомно-силової мікроскопії для діагностики вірусів.

В 1986 році був створений перший атомно-силовий мікроскоп. З того часу він значно вдосконалився і зараз знаходить широке застосування в різних галузях науки, а також в діагностиці вірусів зокрема.

Кварцовий елемент цього приладу випромінює промінь, що контактує з поверхнею досліджуваного об’єкта, в нашому випадку – з поверхнею вірусної частки.Перевагою цього методу є те, що, на відміну від електронного мікроскопа, атомно-силовий не потребує вакуума, можна досліджувати об’єкт на поверхні рідини у висушеному стані, тобто досліджувати живі об’єкти з відносно недеформованою структурою.

Атомно-силовий мікроскоп забезпечує 3 режима роботи: контактний, напівконтактний та безконтактний. В вірусології та інших галузях біології використовуються контактний та напівконтактний режими. Контактний режим дозволяє визначити топографію досліджуваних об’єктів, сили тертя, локальну жорсткість та опір розтікання. Напівконтактний режим дозволяє досліджувати фазовий контраст, також топографію, забезпечує магнітно-силову мікроскопію. Безконтактний режим застосовується в фізиці.

Для підвищення чіткості дослідження необхідно зменшувати площу сканування.

37.Атомно-силова мікроскопія.

В 1986 році був створений перший атомно-силовий мікроскоп. З того часу він значно вдосконалився і зараз знаходить широке застосування в різних галузях науки, а також в діагностиці вірусів зокрема.

Кварцовий елемент цього приладу випромінює промінь, що контактує з поверхнею досліджуваного об’єкта, в нашому випадку – з поверхнею вірусної частки.

Переваги: має високу роздільну здатність (вищу ніж у електронної мікроскопії), на кристалічних зразках дає можливість отримати зображення окремих атомів, можливість дослідження нативних клітин без будь-якої їх обробки (напилення, контрастування). Але препарати вірусів вимагають підготовчого етапу: препарат наносять на поверхню золота, слюди, форм вару. Для одержання зображення використовують мініатюрну голку з надтвердого матеріалу (зонд), яка, злегка доторкуючись, пересувається по поверхні досліджуваного зразка. Голка знаходиться на пружній пластинці, що закріплена одним кінцем. Згинання вільного кінця пластинки (відносно голки) зумовлено силою взаємодії голка-зразок і визначається оптичним методом за відхиленням відбитого лазерного променя. Переміщення голки забезпечується спеціальним мікроманіпулятором. Результати аналізуються комп'ютером. На моніторі виникає зображення у трьох проекціях що дозволяє за допомогою комп'ютерних систем визначати обємні параметри ВТМ, бактеріофагу Т4

38. Ренгено-структурний аналіз вірусів

Рентгенівське проміння є однією з форм електромагнітного випромінювання, але внаслідок того що довжина хвилі рентгенівського проміння значно менше ніж світлових хвиль – їх використання дозволяє побачити значно менші деталі. Проте, на відміну від видимого світла або потоку електронів рентгенівське проміння не можна сфокусувати, і після їх проходження через зразок отримати звичайне зображення. Структуру зразка можна виявити використовуючи дифракція рентгенівського проміння.

Візьмемо за приклад зразок що розташований на шляху будь-якого випромінювання, довжина хвиль якого меньша розмірів зразка. Зразок буде розсіювати частину випромінювання. Розсіяне випромінювання можна розглядати як набор хвиль що перекриваються, кожна з яких відбивається різними частинами об’єкта. Якщо хвилі перекриваються, вони піддаються інтерференції, і виникає розподіл випромінювання, відомий як дифракційна картина. Вона може бути зареєстрована на фотопластинці або представлена за допомогою кількості розсіюваного випромінювання, відбитого об’єктом. Форма дифракційної картини і є структурою об’єкта.

39. Серологічні методи дослідёження у вірусології

Всі серологічні реакції базуються на специфічній взаємодії антигену з антитілом. З поняттям “антигенність” пов’язують три властивості:

§ Здатність індукувати утворення антитіл при введенні тваринам або викликати імунологічну реакцію.

§ Здатність виявляти специфічність утворених антитіл.

§ Здатність специфічно з’єднуватись з утвореними антитілами.

Основні компоненти серологічних реакцій: Антигени і Антитіла (поліклональні та моноклональні)

Застосування серологічних реакцій

§ при лабораторній діагностиці вірусних захворювань, особливо, коли виділення вірусу неможливе або ускладнене і потребує багато часу, коли віруси не викликають змін в культурі клітин і не розмножуються в ній, не здатні викликати експериментальну інфекцію у лабораторних тварин.

§ в епідемічній практиці для оперативного епідеміологічного аналізу і формування цілеспрямованих протиепідемічних заходів (вакцинація, діагностика, лікування) у вогнищах вірусної інфекції.

§ для оцінки ефективності противірусних вакцин та хіміотерапевтичних препаратів, для виявлення природних резервуарів вірусу і т.д.

§ діагностики фітовірусних інфекцій.

40. Основні компонени серологічних реакцій.

Для постановки серологічних реацій неохідні наступні компоненти:

1. Антигени(це можуть бути очищені ввіруси, матеріал що містить віруси(культуральна, алантоїсна або амніотичні рідини, гомогенати органів лабораторних тварин, рото глоткові, носові змиви, пункції), окремі компоненти вірусів – структурні поверхневі білки)

2. Антитіла. Антисироватки отримують у 3 етапи:

А – приготування високо очищеного концентрованого антигену

Б – імунізація лабораторних тварин, з використанням невеликих доз антигенів, бо саме такі дози індукують синтез високоавідних антитіл. Найбільш високі титри антитіл отримують при внутрішньовенних ін’єкціях.

В – тестування отриманої сироватки в присутності гомологічного антигену.

41. Моноклональні антитіла

Моноклональні антитіла виробляються окремими клонами плазматичних клітин. Антитіла визначеного клону імунохімічно ідентичні і реагують зі специфічним епітопом антигену, проти якого вони продуковані.

Моноклональні антитіла мають цілу низку переваг у порівнянні з поліклональними антитілами, а саме: висока гомогенність, відсутність неспецифічних антитіл, простота розпізнавання і відсутність варіативності від партії до партії зразків. Хоча слід зазначити деякі недоліки при використанні моноклональних антитіл. Тест методи для добору корисних клонів і контролю якості повинні бути ідентичні використовуваним методам.

Епітоп-ціль повинна бути унікальною до заданого антигену. Специфічність, одна з найбільших переваг моноклональних антитіл, губиться, коли дію антитіл спрямовано проти епітопу, що входить до складу двох чи більш антигенів. Якщо перехресну реактивність поліклональної антисироватки може бути усунуто, то способів усунути перехресну реактивність моноклональних антитіл - не існує. При використанні скринінгових методів варто також брати до уваги, що моноклональні антитіла, у порівнянні з поліклональними, більше піддаються впливу навколишніх факторів таких, як рівень рН і тип розчину.

42. Реакція гемаглютинації та її застосування.

Аглютинація зумовлена взаємодією поверхневих вірусних білків (у простих вірусів це білки капсиду, у складних – білки суперкапсиду гліко - та ліпопротеїни) з рецепторами еритроцитів без участі специфічної антисироватки. Ці вірусні білки дістали назву гемаглютининів.

Гемаглютинуючі властивості мають багато вірусів: ортоміксовіруси, параміксовіруси, рабдовіруси, поксвіруси, реовіруси, аденовіруси та інші.Механізм гемаглютинації

§ гемаглютинин взаємодіє з поверхневими білками еритроциту (глікопротеінами), в результаті чого відбувається адсорбція вірусу на еритроциті, що призводить до утворення агрегату, який осідає на дно пробірки чи лунки планшету тонкою плівкою у вигляді перегорнутої парасольки (повна аглютинація).

§ Якщо реакція не відбулась, тобто в розчині відсутні гемаглютинуючі віруси, то еритроцити осідають на дно щільним п’ятачком.

§ Взаємозв’язок між вірусом та еритроцитами є зворотним і може наступити фаза елюції (звільнення) вірусу, наприклад за допомогою ферменту вірусу нейрамінідази,що дисоціює утворені зв’язки.

Застосування РГА

§ Реакція гемаглютинації широко застосовується у вірусологічній практиці як швидкий, технічно простий дешевий та достатньо надійний метод виявлення гемаглютинуючих вірусів в досліджуваному матеріалі

§ для титрування вірусів.

43. Реакція непрямої гемаглютинації(РНГА) та її застосування

Суть реакції непрямої аглютинації в тому, що еритроцити з попередньо адсорбованими антигенами, здатні аглютинуватись в присутності гомологічних сироваток (АТ). Еритроцити виконують роль носія зі специфічними детермінантами і склеювання їх відбувається в результаті взаємодії антиген – антитіло та реєструється візуально за характером утворюваного осаду

РНГА дуже чутлива реакція, за її допомогою можна виявити 0,01 мг/мл АГ, а за специфічністю вона наближується до ІФА.

Існує дві модифікації РНГА:

1. Адсорбція антигенів на поверхні еритроцитів, з наступною аглютинацією в присутності гомологічної сироватки.

2. Адсорбція антитіл на поверхні еритроцитів з наступною аглютинацією в присутності гомологічного вірусу.

За позитивний результат приймають аглютинацію еритроцитів(вони вільно розміщені по дну лунки), за негативний – компактне осадження еритроцитів у вигляді диска на дно лунки. Облік результатів проводять після осадження еритроцитів в контрольних лунках.

РНГА використовують для діагностики таких збудників інфекційних захворювань як кір, респіраторно - синцитіальний кліщового енцефаліту, сказу, аденовірусних хвороб, інших.

44. Реакція звязування комплементу(РЗК).

1.РЗК вперше була описана Борде і Жангу в 1901р і базується на двох феноменах: бактеріолізу і гемолізу. Явище бактеріолізу було помічено в 1894р Пфейфером та Ісаєвим: при імунізації морської свинки послабленою культурою холерних вібріонів в їх сироватках накопичуються специфічні антитіла – бактеріолізи. Вони лізують in vitro живі холерні вібріони в присутності комплементу.

2.Феномен гемолізу вперше спостерігав Борде в 1898р: при повторному введенні еритроцитів барана кролям, в їх сироватках утворювались специфічні АТ - гемізіни, які розчиняють (лізують) баранячі еритроцити лише в присутності комплементу.

3.Об’єднавши обидва явища (бактеріолізу і гемолізу) і розмістивши між ними мінімальну кількість комплементу, Борде і Жангу створили класичну реакцію зв’язування комплементу, яка тепер широко застосовується для лабораторної діагностики бактеріальних та вірусних захворювань.

4.Антитіла, які виявляються в РЗК, називаються комплементзв’язуючими. Як правило, вони виявляються наприкінці першого на початку другого тижня захворювання, потім титр їх зростає, досягає максимуму і поступово знижується. Зростання титру та тривалість зберіганні антитіл неоднакові при різних типах збудників. Наприклад, при грипі антитіла зберігаються до 2 років, а при віспі – протягом життя.

Компоненти РЗК:

1.досліджувані та контрольні сироватки інактивовані (для усунення антикомплементарності) прогріванням при 56 – 60С протягом 30хв;

2.матеріал, що містить вірус (теж відповідним чином оброблений для усунення антикомплементарності) або стандартні діагностикуми;

3.гемолізін (гемолітична сироватка) – інактивована сироватка кроля, імунізованого еритроцитами барана;

4.еритроцити барана – 3% завись дефібринованої крові на фізіологічному розчині;

5.комплемент – неспецифічний термолабільний білок, який входить до складу свіжої крові тварин і людей. Найчастіше використовують свіжу, консервовану або суху сироватку морських свинок;

6.фізіологічний розчин – 0,85% NaCl на дистильованій воді.

Реакцію зв’язування комплементу використовують для:

1.виявлення в сироватках специфічних АТ в присутності стандартних АГ

2.для виявлення природи невідомих антигенів за допомогою діагностичних імунних сироваток.

3.В вірусології за допомогою РЗК визначають АГ та АТ з метою ранньої та ретроспективної (після захворювання) діагностики вірусних хвороб;

4.при вивченні розмноження вірусу в організмі тварин, в курячих ембріонах, в культурі клітин. При цьому важливо досліджувати парні сироватки, які беруть в перші дні хвороби та між другим та третім тижнем захворювання. Відсутність або мала кількість АТ в перших пробах сироватки та 2- чи 4-кратне збільшення титру АТ у другій, свідчить про перенесення хвороби.

45. Реакція нейтралізації(РН).

Принцип реакції полягає у тому що в пробірці поєднують рівні обєми сироватки крові та суспензії вірусу і після витримки визначають, чи зберігся в суміші активний вірус. Проводять це шляхом зараження сумішю чутливої до даного вірусу живої системи(біпроба на тест-обєктах). Відсутність дії вірусу на тест-обєктах при позитивному контролі розцінюють як свідотство нейтралізації біологічної активності вірусу антитілами сироватки і, відповідно, гомологічності антитіл сироватки і антигенів вірусу. При цьому чим більше в сироватці антитіл до даного вірусу, тим в більш високому розведенні вона ще здатна нейтралізувати певну(стандартну) дозу вірусу. У випадку позитивної біпроби рахують, що нейтралізація вірусу не відбулась, так як сироватка не містить антитіл до взятого вірусу.

РН ставлять коли:

змішують рівні обєми різних розведень сироватки з постійною дозою вірусу

Зєднують рівні обєми одного і того ж розведення сироватки із зростаючими дозами вірусу.

1.Реакція нейтралізації (РН) широко застосовується в вірусологічній практиці. З її допомогою можна виявити наростання антитіл в сироватці крові перехворівших або імунних організмів, можна ідентифікувати віруси та виявляти їх антигенну структуру.

2.Наявність нейтралізуючої вірус активності сироваток людей та лабораторних тварин можна виявляти в дослідах на тваринах (наприклад, на мишах), на курячих ембріонах і в культурі клітин.

3.В РН встановлюється здатність імунної сироватки (антитіл) пригнічувати інфекційні властивості вірусу, тобто його здатність до розмноження в чутливих тканинах.

4. Як правило, реакція нейтралізації високоспецифічна, тобто імунна сироватка нейтралізує тільки гомологічні штами вірусу. Але в сироватках здорових людей і тварин присутні неспецифічні інгібітори, тому правильніше говорити не про антитіла, що нейтралізують вірус, а про активність сироватки, що нейтралізує вірус, яка в деяких випадках може бути неспецифічною. Тому під час роботи необхідно ставити відповідні контролі (перевіряти нейтралізуючу активність сироватки на специфічність до імунізації або в перші дні захворювання).

46. Умови реакції преципітації між АГ і АТ в серологічній реакції.

Реакції між АТ та АГ, які відбуваються в умовах in vitro, мають типові характеристики:

- необхідність електролітів (оптимальним є ізотонічний розчин з рН близьким до нейтрального)

- зворотність (можлива дисоціація комплексу АГ – АТ при зміні умов постановки реакції)

- двофазність (фаза взаємодії АГ з АТ та фаза проявлення – візуалізація утвореного комплексу)

47. Серологічні тести, які базуються на явищі преципітації

- Преципітація в краплі

- Преципітація в пробірці

- Кільцепреципітація

- Реакція преципітації в гелі – імунодифузія

- Імуноелектрофорез

- Проста радіальна імунодифузія

- Зустрічний електрофорез

- Ракетний електрофорез

48. Реакція преципітації в гелі – імунодефузія

Преципітація – взаємодія між розчиненими АГ і специфічними АТ, результат цієї взаємодії -преципітат. Реакція характеризується високою чутливістю, простотою, її можна виконувати як в лабораторіях, так і в полоьових умовах. Принцип реакціїї преципітації заключається в утворені комплексів АГ-АТ в вигляді решітки. Один з варіантів з’єднання: молекули АГ являються вузлами решітки, а молекули АТ – звязуючими ланцюгами. Зєднання відбувається за рахунок притягання полярних груп АГ детермінант і активного центру. Мінімальна кількість вірусу необхідна для утворення видимого преціпітата 0,1 – 1 мкг. Проходження реакціїї преципітації в гелі дозволило досліджувати індивідуально кожну пару АГ-АТ, так як антиген дифундує назустріч АТ з певною швідкістю. Отже реакції засновані на здатності до дифузії в гелях АТ і розчинених АГ і відсутності такої здатності у комплексу АГ-АТ, який утворюється при контакті дифундуючих назустріч один одному гомологічних АГ та АТ. Комплекс АГ- АТ осаджується в тій ділянці, де співвідношення АГ і АТ є оптимальним, в результаті утворються смуги преципітації в вигляді мутно білих ліній в гелі. Тести, основані на імунодифузії повязані з розділенням суміші АГ та АТ за розміром часток, коефіцієнтом дифузії і концентрації реагентів. Ці методи дозволяють одночасно визначати специфічність антисироваток, ступінь АГ-спорідненості між досліджуваними вірусами та їх штамами, вести контроль за чистотою моноспецифічних сироваток і антигенів.

Імуноелектрофорез

Імуноелектрофорез – це метод дослідження антигенного складу матеріалів, що поєднує електрофорез та імунопреципітацію. Спочатку проба антигенного матеріалу розганяється електрофорезом в гелі, в результаті чого формуються характерні зони. Потім паралельно зонам електрофорезу вноситься антисироватка, яка дифундує в гелі, в місці зустрічі з антигеном з’являються лінії преципітації. Число, положення і форма цих дуг дають уявлення про склад семіші антигенів у зразку. Таким чином, за допомогою імуноелектрофорезу можна визначити тільки ті компоненти зразка, які здатні давати реакцію преципітації з антитілами. Використання барвників, які реагують з досліджуваними речовинами зразка, робить дуги преципітації помітнішими. Якщо ці речовини містять якісь компоненти(метали, вуглеводи, ліпіди) то за допомогою характерних для них хімічних реакцій, можна визначити наявність цих компонентів і охарактеризувати будь яку дугу преципітації. Шляхом імуноелектрофорезу можна дуже повно і точно визначити компоненти складних сумішей за їхньою електрофоретичною рухливістю та імунологічною специфічністю, а також визначити відносну концентрацію досліджуваних компонентів, а в деяких випадках – про їхнє хімічні властивості та фізіологічну активність.

Основними об’єктами імуноелектрофоретичних досліджень є сироватка крові, сеча, спинномозкова рідина, а метою у таких дослідженнях – визначення станів, які супроводжуються наявністю паталогічних білків, браком білкових компонентів.