Инструменты генетической инженерии

Инструментами генетической инженерии являются ферменты (рестриктазы и лигазы) и векторы.

Рестриктазы — это ферменты (молекулярные ножницы), разрезающие двуцепочечную молекулу ДНК в узнаваемой ими определенной последовательности нуклеотидов. Причем каждая рестриктаза узнает свою последовательность нуклеотидов ДНК, независимо от ее видовой принадлежности, прикрепляясь к ней и разрезая ее в месте прикрепления. Обычно рестриктазы распознают в молекуле ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4—6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором — стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят друг за друга, образуя «липкие» концы, способные соединяться между собой в силу комплементарности. «Сшивание» выступающих «липких» концов фрагментов двуцепочечной молекулы ДНК осуществляет фермент ДНК-лигаза. Он «сшивает» между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК.

Векторы – это специальные устройства для доставки чужеродных генов в различные организмы Идеальными векторными молекулами являются плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий. Они также имеют участки ДНК для действия ряда рестриктаз. Разрезав кольцо плазмидной ДНК, рестриктаза своим действием переводит ее в линейное состояние, после чего ее можно соединить с фрагментом ДНК другого вида с подходящими «липкими» концами. Помимо плазмид, в качестве векторов применяют также фаги и вирусы.

35. Принцип действия и функции ДНК – рестриктаз и лигаз

Рестриктазы — это ферменты (молекулярные ножницы), разрезающие двуцепочечную молекулу ДНК в узнаваемой ими определенной последовательности нуклеотидов. Причем каждая рестриктаза узнает свою последовательность нуклеотидов ДНК, независимо от ее видовой принадлежности, прикрепляясь к ней и разрезая ее в месте прикрепления. Обычно рестриктазы распознают в молекуле ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4—6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участковили с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором — стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят друг за друга, образуя «липкие» концы, способные соединяться между собой в силу комплементарности. «Сшивание» выступающих «липких» концов фрагментов двуцепочечной молекулы ДНК осуществляет фермент ДНК-лигаза. Он «сшивает» между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК.

36. Амплификация фрагментов ДНК с помощью метода ПЦР

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60°C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин. Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах.

37. Векторные системы применяемые для клонирования в клетках прокариот и эукариот

Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента ДНК в клетку хозяина для прокариот и эукариот различны. Для клонирования в прокариотических клетках используют плазмиды, фаги и космиды. В зависимости от типа векторной системы, используемой для доставки клонируемого фрагмента ДНК, процесс переноса генов носит название: при использовании плазмиды — трансформации; при использовании фага - трансдукции. Перенос экзогенной ДНК в эукариотические клетки называют трансфертен. В качестве векторов для переноса ДНК в эукариотические клетки используют дрожжевые плазмиды (единственные плазмиды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотические вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляют путем ко-трансформаций — одновременного введения плазмиды и сегмента чужеродной ДНК. В клетках эукариот векторные конструкции сохраняются в виде эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина.