Биологические методы анализа

методы качеств. обнаружения и количеств. определения неорг. и орг. соединений, основанные на применении живых организмов в кач-ве аналит. индикаторов. Живые организмы всегда обитают в среде строго определенного хим. состава. Если нарушить этот состав, напр., исключив из питательной среды определяемый компонент или введя его дополнительно, организм через нек-рое время подаст соответствующий сигнал. В Б. м. а. устанавливаются связи характера и (или) интенсивности ответного сигнала с кол-вом определяемого компонента. В кач-ве индикаторов применяются микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесневые грибы), водоросли и высшие растения, водные беспозвоночные и позвоночные животные (простейшие, ракообразные, моллюски, личинки комаров, олигохеты, пиявки, рыбы и др.), насекомые, черви, а также ткани, разл. органы и системы (нервная, кровеносная, половая и др.) теплокровных. Питательная среда м. б. естественной, искусственной или синтетической.

Основными источниками попадания микробов в молоко являются вымя и кожный покров животного, руки доярки, посуда, воздух и др. В процессе хранения молока микроорганизмы изменяют его свойства. Для более длительного сохранения первоначальных свойств молока необходимо снижать до минимума возможности попадания в него микроорганизмов в процессе хранения и транспортирования.

При исследовании необходимо обращать внимание на количественный и видовой состав микрофлоры молока. Это дает возможность правильно вести борьбу с возбудителями порчи молока.

В молоко при нарушении санитарных требований могут попасть бактерии кишечной группы, маслянокислые, гнилостные (аэробы и анаэробы), дрожжи, микроскопические грибы, которые вызывают различные пороки молока и молочных продуктов.

Отбор проб. Для бактериологического исследования молока и сливок после тщательного перемешивания отбирают около 50 см³ продукта стерильным пробоотборником или черпаком в стерильную колбу, которую затем закрывают пробкой. Взятые пробы необходимо сразу же исследовать. Если взятые пробы предназначены для отправки в лабораторию, то их необходимо охладить до 5…6°С. При такой температуре можно перевозить или хранить пробы, но не более 4 ч с момента отбора. Перед отправкой образцы пломбируют или опечатывают, оформляют сопроводительный документ, в котором указывают дату, час отбора пробы, температуру продукта, должность и подпись бравшего пробу.

Определение общего количества микроорганизмов. При определении общего количества микроорганизмов в молоке рекомендуются следующие нормы разведения: молоко сырое 1, 2, 3, 4, 5. Молоко пастеризованное 1, 2, 3.

По 1 см³ соответствующих разведений высевают в чашки Петри и заливают расплавленной питательной средой, охлажденной до температуры 45 °С (сусло-агар, МПА) в количестве 12…15 см³. Сразу после заливки содержимое тщательно перемешивают, покачивая чашки для равномерного распределения посевного материала. Выращивание ведут в течение 2 сут при температуре 37°С.

Для определения общего количества бактерий следует выбирать те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном (без крышки) на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 8…10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками.

Для подсчета общего количества бактерий в 1 см³ или 1 г образца число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам складывают, делят на количество подсчитанных чашек и выводят среднее арифметическое, которое принимают за окончательное. Полученные числа округляют.

Количественный учет молочнокислых бактерий. Количество молочнокислых бактерий учитывают чашечным методом и методом предельных разведений.

Чашечным методом молочнокислые бактерии учитывают путем посева соответствующего разведения продукта по 1 см³ в чашки Петри, где его заливают агаром с гидролизованным молоком и мелом. Посевы выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение 3 сут. Колонии молочнокислых бактерий распознают по зонам просветления, которые образуются в результате растворения мела молочной кислотой.

Метод предельных разведений применяют при анализе продуктов, в которых молочнокислая микрофлора состоит из молочнокислых стрептококков и палочек (сыры, южные кисломолочные продукты).

В качестве питательной среды для молочнокислых бактерий используют обезжиренное молоко. Берут ряд последовательных разведений исследуемого продукта в стерильной воде с таким расчетом, чтобы последние не содержали молочнокислых бактерий.

Например, если в 1 см³ исследуемого продукта содержится 1000 клеток молочнокислых бактерий, то приготовляют следующие разведения:

Из приготовленных разведений делают посевы по 1 см³ в стерильное обезжиренное молоко (по две пробирки из каждого разведения). Заведомо не содержавшее бактерий (последнее) разведение берут для доказательства того, что определено то наименьшее количество исследуемого продукта, в котором уже не содержится молочнокислых бактерий.

Посевы ставят в термостат при 30 °С на 7 сут. В течение этого времени во всех пробирках, в которых содержались молочнокислые бактерии, должно свернуться молоко. В каждой пробирке со свернувшимся молоком определяют кислотность и из сгустка готовят микроскопический препарат.

Если кислотность сгустка не ниже 60 °Т и в препарате видны стрептококки или палочки, делают вывод, что в нем содержатся молочнокислые бактерии.

При подсчете количества молочнокислых бактерий пользуются специальной таблицей.

Определение эффективности пастеризации. Для определения эффективности пастеризации молока или сливок проводят не менее двух исследований: перед пастеризацией и тотчас после нее. Пробы для исследования берут непосредственно из аппарата в стерильную посуду и сразу же охлаждают.

Для учета остаточной микрофлоры проводят посев молока с разведениями 1/10, 1/100 в чашки Петри на МПА. При исследовании молока перед пастеризацией берут разведения 1/100, 1/1000, 1/10 000 и засевают в чашки Петри на МПА. Эффективность пастеризации можно считать достаточной, если объем остаточной микрофлоры составляет не более 0,01 % объема первоначальной. Существуют и другие методы определения эффективности пастеризации, например метод Н.С. Королевой.

Определение коли-титра молока. Коли-титром называется наименьшее количество исследуемого продукта, в котором устанавливается наличие бактерий из группы кишечной палочки (род кишечной палочки должен быть установлен путем идентификации).

Коли-титр характеризует санитарно-гигиенический режим получения и обработки молока и условия содержания лактирующих коров.

В сыром молоке и сливках определяют бродильный титр. Под бродильным титром понимают наименьшее количество продукта, в котором присутствует хотя бы одна клетка бактерий группы кишечной палочки. Титр кишечной палочки определяют методом бродильных проб.

Коли-титр определяют в три этапа: первая бродильная проба (посев на среду Кесслера), вторая бродильная проба (пересев со среды Кесслера на среду Эндо), третья бродильная проба (пересев со среды Эндо на среду Симмонса или Козера). Бродильный титр определяют только первой бродильной пробой.

Для определения коли-титра засевают молоко в шесть пробирок со средой Кесслера: в три – по 1 см³ и в три – по 0,1 см³. После инкубации в термостате при температуре 43…45°С в течение 18..24 ч (первая бродильная проба) просматривают и устанавливают бродильный титр сырого молока. Отсутствие газа во всех пробирках свидетельствует о том, что продукт не загрязнен бактериями группы кишечных палочек. Появление газа свидетельствует о возможном загрязнении продукта кишечной палочкой. Для подтверждения наличия кишечной палоч­ки проводят пересев из пробирок, в которых обнаружено газообразование, на среду Эндо в чашки Петри. Выращивают в течение 18..24 ч при температуре 37°С (вторая бродильная проба).

При появлении в среде Эндо красных с металлическим блеском или розовых слизистых колоний их изучают выборочно. Изолируют 1…2 наиболее типичные колонии из каждого сектора чашки Петри. Из них делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.

При наличии в мазках грамотрицательных палочек, неспорообразующих, подозрительных в отношении бактерий группы кишечной палочки, проводят высев на среду Симмонса с целью идентификации и дифференциации рода Escherichia и бактерий родов Citrobacter и Enterobacter (третья бродильная проба).

Кишечная палочка (Е. coli) относится к цитратотрицательным бактериям, она не способна усваивать углерод из солей лимонной кислоты и расти на этой среде. Штаммы кишечной палочки, выросшие на среде Симмонса с изменением ее цвета из оливково-зеленого в светло-синий являются цитратположительными и относятся к родам Citrobacter или Enterobacter и не учитываются.

Коли-титр пастеризованного молока и сливок устанавливают по следующим показателям:

-ни в одной из пробирок газообразование не обнаружено – коли-титр более 3;

-в одной из трех засеянных по 1 см³ пробирок обнаружены признаки брожения – коли-титр 3;

-брожение обнаружено более чем в одной пробирке с 1 см³ или хотя бы в одной из пробирок с 0,1 см³ – коли-титр 0,3;

-брожение обнаружено во всех пробирках с посевами от обоих разведений, а также в том случае, если брожение обнаружено в трех пробирках любогоразведения и в двух пробирках другого – коли-титр менее 0,3.

Коли-титр исследуемого пастеризованного молока или сливок вычисляют, руководствуясь табл. 5.

Коли-титр кефира, ацидофильного молока, простокваши, ацидофильно-дрожжевого молока, напитка Южный вычисляют так же, как и у пастеризованного молока.

Во всех видах молочных продуктов и в молоке не должно содержаться патогенных микроорганизмов. Об этом судят по коли-титру. В продуктах детского питания в 1 см³ (1 г) допускается присутствие не более 5000 бактерий (коли-титр более 3).

Таблица 5 – Расчет коли-титра

Обозначения: + кишечная палочка рода Эшерихия присутствует;

- кишечная палочка рода Эшерихия отсутствует

Определение количества протеолитических бактерий. Протеолитические бактерии учитывают при посеве исследуемого материала на молочный агар. Приготовление разведений посева то же, что и при количественном учете микрофлоры чашечным методом. Чашки с посевами помещают в термостат при 30^оС. Колонии подсчитывают через 36…48 ч. Протеолитические бактерии на вышеуказанной среде при своем росте образуют широкие зоны просветления (протеолиза) вокруг колоний. Пептонизирующие бактерии (микрококки, маммококки) образуют узкие зоны пептонизации.

Определение титра маслянокислых бактерий. Вначале делают соответствующие разведения исследуемого материала, затем засевают в пробирки со стерильным цельным молоком. После посева пробирки нагревают в водяной бане до 85°С в течение 10 мин и помещают в термостат, где выдерживают при 30°С в течение 3 дней. Наличие маслянокислых бактерий определяют по образованию газа, запаху масляной кислоты, наличию в мазке спорообразующих бактерий, имеющих форму барабанных палочек, дающих с йодом положительную реакцию на гранулезу. По результатам исследования определяют титр. Титром считают то наибольшее разведение молока, в котором обнаруживается рост маслянокислых бактерий.

Определение количества дрожжей и микроскопических грибов. Делают различные разведения исследуемого материала и проводят посев в чашки Петри с сусло-агаром. Посевной материал выдерживают в термостате в течение 3 дней при 30°С. Подсчитывают отдельно колонии дрожжей и колонии плесневых грибов. Затем умножают на разведение и получают количество тех и других в 1 см³. При подсчете колоний в нескольких чашках определяют среднее их количество.

Определение общего количества бактерий в молоке косвенным методом. Для определения бактериальной чистоты и свежести молока проводят пробу на редуктазу, основанную на способности бактерий выделять редуктазу, восстанавливающую краски (метиленовый синий, резазурин). Обесцвечивание метиленового синего и резазурина наступает тем быстрее, чем больше микробов в молоке.

Проба с метиленовым синим: в пробирки наливают 20 см³ молока и 1 см³ метиленового синего или 10 см³ молока и 0,5 см³ метиленового синего. После тщательного смешивания пробирки помещают в редуктазник или водяную баню с температурой воды 38°С. Такую температуру поддерживают в течение всего опыта до полного обесцвечивания молока.

Первые 20 мин наблюдения ведут непрерывно, в дальнейшем просмотр пробирок проводят периодически через 2 и 5,5 ч после начала анализа. Пробы проводят не реже 1 раза в декаду.

Раствор метиленового синего готовят следующим образом: 5 см³ насыщенного спиртового раствора метиленового синего прибавляют к 195 см³ дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения полученного раствора не более 7 сут. По скорости обесцвечивания метиленового синего молоко разделяют на 4 класса (табл. 6).

Проба с резазурином: в стерильные пробирки вносят по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого молока, закрывают корковыми пробками, смешивают путем трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник или ставят на водяную баню с температурой воды 38 °С и защищают от действия прямых солнечных лучей. Показания снимают через 20 мин и через 1 ч, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Через 20 мин пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из редуктазника или водяной бани. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывается. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и оставляют в редуктазнике до конца анализа.

Основной раствор готовят следующим образом: 100 г резазурина растворяют в 200 см³ стерильной дистиллированной воды, хранят в холодильнике, защищая от света. Рабочий раствор готовят, разбавляя основной раствор водой в соотношении 1:2,5 (например, к 10 см³ основного раствора добавляют 25 см³ воды). Срок хранения рабочего раствора при температуре 8…10°С в течение 7 сут.

В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов (табл. 6).