Главная Случайная страница


Полезное:

Как сделать разговор полезным и приятным Как сделать объемную звезду своими руками Как сделать то, что делать не хочется? Как сделать погремушку Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами Как сделать идею коммерческой Как сделать хорошую растяжку ног? Как сделать наш разум здоровым? Как сделать, чтобы люди обманывали меньше Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили? Как сделать лучше себе и другим людям Как сделать свидание интересным?


Категории:

АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника






Серологическая идентификация. Иммунофлюоресценция. Из проб органов (лимфоузлы, селезенка, почки, миндалины) готовят замороженные срезы





Иммунофлюоресценция. Из проб органов (лимфоузлы, селезенка, почки, миндалины) готовят замороженные срезы. Из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата - маз­ки. Для приготовления последних берут грудную кость, делают продольный разрез и выни­мают красный костный мозг, из которого делают несколько мазков. Для приготовления мазков из лейкоцитарного концентрата от больных или подозреваемых в заболевании сви­ней берут 15 мл крови с антикоагулянтом, энергично встряхивают, оставляют на 1 ч при комнатной температуре, затем отбирают плазму с лейкоцитами и центрифугируют 10 мин при 1000 мин-1, из осадка лейкоцитов (беловатый осадок) делают 2-3 мазка. Приготовлен­ные препараты (срезы и мазки) фиксируют в охлажденном ацетоне 10 мин, после испарения ацетона промывают 15-20 мин в ФБР рН 7,2 и окрашивают при 37°С 30 мин конъюгатом в рабочем разведении, к которому добавляют краситель Эванса в соотношении: 3 части конъюгата и 1 часть красителя, затем препарат промывают в фосфатном буфере и оставля­ют на 10 мин в дистиллированной воде. После частичного подсушивания на воздухе на пре­парат наносят забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть ФБР рН 8), покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Аналогично ставят контроли: а) исследуемый материал и нормальный конъюгат с красителем Эванса; б) не инфицированный материал и специфический конъюгат с красителем Эванса.

При микроскопии фон препарата флюоресцирует красно-оранжевым цветом, ядра кле­ток темные, специфическое свечение характеризуется зеленым цветом цитоплазмы. В маз­ках из красного костного мозга и лейкоцитарного концентрата специфическая флюоресцен­ция отличается большой яркостью и количеством флюоресцирующих клеток. Специфиче­ское свечение в цитоплазме даже в отдельных клетках препаратов, полученных от подозри­тельных по заболеванию животных, указывает на наличие вируса КЧС. В контрольных пре­паратах подобного свечения не должно быть.

Указанный метод отличается специфичностью и быстротой. Однако во избежание по­грешностей метода при внедрении его в лаборатории следует иметь в виду, что специфич­ность результатов зависит от следующих факторов: качества сыворотки-маркера (она долж­на иметь высокие титры, быть моновалентной, полученной от свиней, не обработанных дру­гими АГ), качества исследуемого материала (должен быть отобран не позже 2-3 ч после смерти животного, фиксирован в ацетоне или замораживанием и сразу же отправлен на ис­следование). В сопроводительном письме необходимо указывать клиническую и эпизоотологическую характеристику болезни, даты и названия прививок. При учете реакции следует иметь ввиду, что вакцинный вирус сохраняется в организме вакцинированных свиней до 15 дн после вакцинации и в ИФ не дифференцируется от полевого вируса.

В Болгарии для ИФ диагностики КЧС из вены больных животных получают кровь, готовят препараты лимфоцитов и лизированных эритроцитов и вносят их в пробирки с пластинками, содержащими культуру клеток СПЭВ. Через определенные промежутки времени пластинки извлекают и подвергают ИФ-обработке для выявления АГ вируса. Пер­вые признаки размножения вируса в клеточном монослое выявляются через 12ч после за­ражения. Максимального развития признаки достигают через 48-72 ч. Ценность прямого метода ИФ повышается при использовании его для прижизненной диагностики путем ис­следования биопсированных миндалин. В Японии с этой целью сконструирован прибор.

Установлено преимущество метода для идентификации АГ вируса с использованием культуры клеток РК-15 по сравнению с исследованием гистопрепаратов или мазков-отпечатков. В случае исследования органов свиней, иммунизированных вирус-вакцинами, когда АГ вакцинного вируса еще можно обнаружить в мазках-отпечатках, существует ре­альная возможность получения ложноположительных результатов. Поэтому для идентифи­кации изолятов ВКЧС чаще применяют метод флюоресцирующих AT в культуре клеток РК-15, который, несмотря на трудоемкость, характеризуется большей чувствительностью и лег­костью учета результатов по сравнению с выявлением АГ в срезах ткани. Через 24-48 ч по­сле заражения обнаруживали флюоресцирующие микробляшки из 5-30 клеток.

При помощи метода ИФ в сочетании с методом культуры клеток удается диагностиро­вать чуму почти у всех больных свиней. В таком сочетании метод позволяет обнаружить ВКЧС и в мясе вынужденно убитых животных. Для обнаружения АГ вируса в миндалинах наиболее эффективен метод непрямой ИФ с контрастированием синькой Эванса.

РНГА. Для обнаружения АГ вируса в патологическом материале из органов и тканей свиней используют следующие компоненты:

а) АТ-эритроцитарный диагностикум;

б) спе­цифический АГ - вирус-вакцина КЧС;

в) нормальный (контрольный) АГ;

г) 1%-ный р-р нормальной лошадиной сыворотки в забуференном физиологическом р-ре с рН 7,2;

д) формалинизированные и танизированные эритроциты барана;

е) исследуемый материал.

РНГА ставят микрометодом в объеме 0,075 мл с помощью аппарата Такачи или Титертек. Готовят двукратные разведения исследуемого материала (от 1:2 до 1:512) в объеме 0,05 мл и такие же разведения контрольных АГ (специфического и нормального). Затем во все луночки вносят 0,025 мл 3%-ной суспензии эритроцитарного диагностикума. Кроме того, ставят дополнительно контроли; а) 0,05 мл 1%-ного р-ра нормальной сыворотки лошади и 0,025 мл эритроцитарного диагностикума;
б) 0,05 мл исследуемого материала в разведениях и 0,025 мл формалинизированных и танизированных эритроцитов. После этого пластинки встряхивают и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре. Учет реакции проводят в крестах по 4-бальной системе. РНГА считают положительной при обнаружении агглютина­ции не менее чем на три креста в разведениях 1:8 и выше.

РДП и ИЭОФ. Реакции различаются методами получения линий преципитации: в РДП это происходит посредством свободной диффузии р-ров АГ и AT из лунок в агаровом геле равномерно во все стороны, а в ИЭОФ АГ и AT движутся строго навстречу друг другу под действием электрического поля, в результате чего увеличивается их концентрация в месте встречи и там образуются более выраженные полосы преципитации.

Для постановки ИЭОФ необходим специальный прибор для электрофореза, дающий ре­гулируемое напряжение постоянного тока до 300В. ИЭОФ в несколько раз чувствительнее метода РДП, требует незначительного количества материала и позволяет получать результа­ты через 30 мин. Метод стандартизован, описана методика приготовления агарозного ге­ля. Он используется для выявления АГ ВКЧС в мезентериальных лимфоузлах и суспензии ткани поджелудочной железы при клинических случаях болезни. Помимо АГ, данный метод позволяет выявлять и специфические AT. Метод быстрый, легко осуществим и более чувст­вителен для лабораторной диагностики КЧС, чем РДП.

Date: 2016-02-19; view: 462; Нарушение авторских прав; Помощь в написании работы --> СЮДА...



mydocx.ru - 2015-2024 year. (0.007 sec.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав - Пожаловаться на публикацию