Методы лабораторных исследований

В основе серологических исследований лежит специфическая реакция между антигенами и антителами.

Антигены - генетически чужеродные вещества, при введении в организм животного (и человека) вызывают ответную реакцию (антигенное свойство) в виде продуцирования защитных тел - антител, специфических по отношению к антигену. Антигенные вещества представляют собой высокомолекулярные соединения, обладающие определенными свойствами: чужеродностью, антигенностью, иммуногенностью, специфичностью, коллоидной структурой и определенной молекулярной массой. Антигенами могут быть разнообразные вещества белковой природы, а также белки в соединении с липидами и полисахаридами. Антигенными свойствами обладают клетки животного и растительного происхождения, яды животных (змей, скорпионов, пчел и др.) и яды растительного происхождения (рицин, кортин и др.), сложные комплексы, состоящие из полисахаридов, липидов, белков. Антигенными свойствами обладают вирусы, бактерии, микроскопические грибы, простейшие, экзо- и эндотоксины микроорганизмов. Различают антигены корпускулярные, клеточные (бактерии, эритроциты) и растворимые (молекулярно-дисперсные). Антигены поливалентны - имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами (антигенная функция) как в организме животного (in vivo), так и вне организма - в пробирке (in vitro). Антигенной функцией обладают не только полноценные антигены, но и неполноценные (гаптены), то есть вещества небелковой природы (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс соматического антигена микробной клетки и др. вещества).

Под антигенностью понимают способность антигена вызывать иммунный ответ. Степень иммунного ответа организма на различный антиген будет неодинакова, то есть на каждый антиген будет вырабатываться неодинаковое количество антител.

Иммуногенность – способность создавать иммунитет. Это понятие относится главным образом к вирусным и микробным антигенам, обеспечивающим создание иммунитета к инфекционным болезням. Чтобы быть иммуногенным, антиген должен быть чужеродным в отношении данного реципиента, иметь молекулярную массу не менее 10000. С увеличением молекулярной массы иммуногенность нарастает. Корпускулярные антигены (бактерии, грибы, простейшие, эритроциты) более иммуногенны, чем растворимые, а среди последних большей иммуногенностью обладают высокомолекулярные, например, агрегированные, антигены.

Специфичность – особенность строения веществ, по которой антигены отличаются друг от друга. Она определяется антигенной детерминантой, то есть небольшим участком молекулы антигена, который и соединяется с выработанным на него антителом. Число таких участков (группировок) у каждых антигенов различно и определяет число молекул антител, с которыми может соединяться антиген (валентность). От числа детерминант зависит валентность антигена: чем больше молекула, тем выше валентность.

Антигены подразделяют на полноценные и неполноценные. Полноценные антигены вызывают в организме синтез антител или сенсибилизацию (сенсибилизация – приобретение организмом специфической повышенной чувствительности к чужеродным веществам,чаще белковой природы, аллергенам) лимфоцитов, и вступают с ними в реакцию как in vivo, так и in vitro. Для полноценных антигенов характерна строгая специфичность, т. е. они вызывают в организме выработку только специфических антител, вступающих в реакцию только с данным антигеном.

Неполноценные антигены, или гаптены представляют собой сложные углеводы, липиды и другие вещества, не способные вызвать образование антител, но вступающие с ними в специфическую реакцию. Добавление к гаптенам небольших количеств белка придает им свойства полноценных антигенов. Белок, который укрупняет молекулу гаптена, получил название «шлеппер» (нем. schlepper – проводник). Гаптенами являются и гетерогенные антигены Форсмана, которые были описаны в
1911 г. Форсман показал, что в органах животных разных видов (кошек, собак, лошадей, кур, морских свинок и др.) содержится общий антиген, но отсутствует у человека, обезьян, кроликов, уток и крыс. Это липоидная фракция, которая обладает свойствами гаптена.

Коньюгированные антигены. Этим термином обозначают белки, которые приобрели новую антигенную специфичность благодаря присоединению к ним с помощью химической связи новой химической группировки.

Антигены животного происхождения по специфичности подразделяют на видовые, групповые, органные и стадиоспецифичные.

Видовая специфичность. Животные разных видов имеют антигены, свойственные только данному виду, что используется при определении фальсификации мяса, групп крови путем применения антивидовых сывороток.

Групповая специфичность характеризует антигенные различия животных по полисахаридам эритроцитов, белкам сыворотки крови, поверхностным антигенам ядерных соматических клеток. Антигены, обусловливающие внутривидовые различия индивидуумов или групп особей между собой, называют изоантигенами, например групповые эритроцитарные антигены человека. Органная (тканевая) специфичность характеризуется неодинаковой антигенностью разных органов животного, например, печень, почка, селезенка отличаются между собой антигенами. Стадиоспецифические антигены возникают в процессе эмбриогенеза и характеризуют определенный этап внутриутробного развития животного, его отдельных паренхиматозных органов.

Аутоантигены. В некоторых случаях белки собственных тканей (сердца, печени, почек и др.) при соединении с белком микроорганизмов, токсинами или ферментами бактерий, лекарственными веществами, под влиянием физических факторов (ожог, облучение, обморожение) изменяют свои физико-химические свойства и становятся чужеродными для организма – аутоантигенами. На эти антигены организм вырабатывает антитела, возникают аутоиммунные болезни.

Антигены микроорганизмов. Вирусы, бактерии, грибы и их отдельные структуры, экзо- и эндотоксины обладают свойством полноценных антигенов.

Различают общие для родственных видов антигены, которые обозначаются как видовые и групповые, и антигены типоспецифические, свойственные определенному типу (варианту). Так как вирусы – сложные антигены, часть которых связана с антигенами наружной оболочки вируса, часть – с внутренним нуклеопротеидом, то и противовирусные антитела обладают выраженной гетерогенностью с широким спектром антител.

Антитела – это специфические белки – иммуноглобулины, которые образуются в организме плазматическими клетками под воздействием антигена и обладающие свойством специфически с ним связываться. Антитела образуются в организме в результате естественного заражения, после введения живых или убитых вакцин, при контакте лимфоидной системы с чужеродными клетками и тканями. Антитела по их функциональным свойствам подразделяются на нейтрализующие, лизирующие и коагулирующие. К нейтрализующим отнесены антитоксины, антиферменты, вируснейтрализующие, антитела лизины; к коагулирующим – агглютинины и преципитины лизирующие – бактериолизины, гемолизины, выделены комплементсвязывающие антитела.

С учетом функциональной способности антител были названы серологические реакции агглютинации, гемолиза, лизиса преципитации и др. антитела разделены на тепловые (вступают в реакцию при 37°С) и холодовые (креофильные) – вступают в реакцию при 4С°. в электрическом поле белки сыворотки крови разделены на альбумины и три глобулиновые фракции: α, β, γ. При электрофорезе установлено, что антитела имеются только в β- и γ-фракциях. При высокоскоростном центрифугировании антитела разделили на две основные группы: 7S (скорость седиментации - осаждения) – небольшие молекулы и 19S – большие молекулы, причем 7S обнаружены в γ-глобулинах, а 19S – в β-глобулинах. Антитела имеют различное количество активных центров в молекуле, это определяет их валентность. Антитела подразделяются на полные и неполные. Полные антитела при взаимодействии с антигеном дают видимые реакции (агглютинации, лизиса, преципитации и др.), неполные антитела после взаимодействия со специфическим антигеном не дают видимого проявления серологических реакций. При введении антигена в организм образуются антитела с различной функциональной активностью (приципитины, агглютинины, лизины и др.). все они идентичны, различно их действие, этих антител не менее 10000.

В соответствии с Международной классификацией антитела называются иммуноглобулинами и обозначаются Ig. Иммуноглобулины - белки с четвертичной структурой, то есть их молекулы построены из нескольких полипептидных цепей. Молекула каждого класса состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух идентичных легких (L) цепей, связанных между собой нековалентными взаимодействиями, дисульфидными мостиками и "хвоста". Легкие цепи являются общими для всех классов и подклассов. Тяжелые цепи имеют характерные особенности строения у каждого класса (подкласса). Легкие цепи подразделены на два типа: К (Kaппa) и l (Лямбда). Тяжелые цепи обозначаются греческими буквами: g (Гамма), m (Мю), a (альфа), d (дельта), e (эпсилон) - соответственно латинскому обозначению того или иного класса иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Hа конце каждой из двух “ветвей” имеются два идентичных антигенсвязывающих участка (в силу этого антитела называют бивалентными), с помощью которых антитела сшивают молекулы антигена в обширную сеть, так как каждая молекула антигена имеет три и более антигенных детерминант. Эффективность реакций связывания и сшивания антигена антителами значительно возрастает благодаря гибкому шарнирному участку в месте соединения обеих "ветвей" с "хвостом".

Иммуноглобулины делят на классы, а также на подклассы. Известно 5 классов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.

Иммуноглобулины – это белки построенные из нескольких полипептидных цепей. Молекула каждого класса состоит из 4 полипептидных цепей – двух тяжелых и двух легких, которые связанны между собой дисульфидными мостиками. Мелкие цепи (I) – общие для всех классов и подклассов. Тяжелые цепи (Н) имеют характерные особенности строения у каждого класса и подкласса. Гетерогенность антител при своей специфичности антитела неоднородны и отличаются друг от друга, они гетерогенны. Существует более 100000 антигенов и к каждому из них синтезируется «свое» специфическое антитело. Антитела реагируют с антигенами благодаря наличию у них определенных структур – активных центров. Активный центр представляет собой полость или щель, которая по конфигурации соответствует детерминантной группе антигена. Активный центр, куда входит детерминантная группа должен быть ей комплементарен, без этого не наступит феномен серологической специфичности. Молекулы антител различных классов различают по валентности, т.е. по количеству у них активных центров. Там IgG и IgA бивалентны (обладают двумя активными центрами), IgM поливалентен, может связать 5-10 молекул антигена. Активность связывания антител с антигеном оценивается такими понятиями, как аффинитет и авидность. Аффинитет характеризует степень совпадения (комплементарности) конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты (как ключ входит в замочную скважину). Под авидностью понимают количество (валентность) и расположение активных центров, характеризующие «жадность» связывания с антигеном всей молекулы антитела.

Свойства антител. Специфичность антител – это способность антител отличать один антиген от другого. Серологические реакции более специфичны и чувствительны, чем химические. Антитела, за очень редким исключением, реагируют только с теми антигенами, против которых они выработаны и подходят к ним как отпечаток к пальцу. Это так называемая комплементарность антител – дополнение к детерминанте антигена.

Аффинность (сродство) – активность антител в расчете на активный центр антигена вне зависимости от числа активных центров на молекулу.

Авидитет – способность антител связывать антигены. Он зависит от аффинности и числа активных центров антитела. При равной аффинности авидность IgM больше, чем авидность IgG, поскольку IgM функционально пятивалентен, а IgG двухвалентен.

Антитела различных классов иммуноглобулинов обладают различными физическими, химическими, биологическими и антигенными свойствами. Иммуноглобулин М первым появляется после заражения или вакцинации животного, обладает выраженной способностью агглютинировать, преципитировать или лизировать антигены, а также связывать комплемент. Находится в плазме крови, у человека 1,0 г/л, при инфекционных заболеваниях количество его значительно повышается. Иммуноглобулин не участвует в аллергических реакциях, не переходит через плаценту. К классу IgM относят антитела группы крови человека – А, В, О.

Иммуноглобулин IgG – наиболее изученный класс антител, содержится в сыворотке крови 12 г/л, составляет от 70 до 85 % всех иммуноглобулинов. Ig играет ведущую роль в защите от многих вирусных и бактериальных инфекций (оспа, бешенство, столбняк и др.), обладает выраженным свойствами нейтрализации токсинов.

Иммуноглобулины класса А делят на два вида: сывороточный и секреторный. Сывороточный IgA масса 170000, содержится в сыворотке крови составляет 15-20 % общего количества иммуноглобулинов, не обладает способностью преципитировать растворимые антигены, не связывает комплемент, принимает участие в реакции нейтрализации токсинов, термоустойчив, синтезируется в селезенке, лимфоузлах и в слизистых оболочках и поступает в секреты – слюну, слезную жидкость, бронхиальный секрет, молозиво.

Секреторный IgA представляет собой полимер, синтезируется в слизистых оболочках. Биологическая функция – в местной защите слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей.

Иммуноглобулин D. Молекулярная масса 10000, 7S. В сыворотке крови человека содержится до 1% от общего количества иммуноглобулинов, является одним из основных иммуноглобулинов, входящих в состав рецепторов В-лимфоцитов; термостабилен, обладает антивирусной активностью, не связывается с тканями.

Иммуноглобулин Е молекулярная масса 19000, 8,5S. Содержится в сыворотке крови 0,25 мг/л, термостабилен, инактивируется при 56°С в течении 1 часа, не связывает комплемента, быстро связывается с клетками тканей. Играет защитную роль при гельминтозах и протозойных заболеваниях, способствует усилению фагоцитарной активности макрофагов и эозинофагов.

Моноклональные антитела. Иммунная система организма вырабатывает специальные антитела на огромном множестве антигенов. В основе этой способности лежит наличие разнообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела одного типа с узкой специфичностью. Общее число клонов у мышей, например, достигает 10⁷-10¹⁰ степени. В ответ на данный антиген в реакцию вовлекается множество клонов, что обусловливает высокую гетерогенность получаемых антител. Поэтому при использовании антисывороток для идентификации и количественно определения антигенов большой проблемой является неспецифическое связывание и перекрестная реакция антител. В 1975г. Д. Кохлер и Ц. Мильстейн предложили метод получения гомогенных антител – метод гибридом. С его помощью проиводят слияние плазмацитомы (опухолевой клетки, возникшей из антинбелокобразующих клеток) с клетками селезенки иммунизированного животного. Таким образом получают гибридные клетки (гибридомы), способные неограниченно размножаться и синтезировать антитела узкой специфичности (моноклональные антитела).

Моноклональные антитела, получили широкое распростронение при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных и человека. Например, получены такие антитела против возбудителя сибирской язвы, бруцеллеза, листериоза, ящура, бешенства, классической чумы свиней, болезни Ауески и т.д.

Таким образом, самым надежным при диагностике различных инфекционных болезней является использование лабораторных методов исследований.