Клеткалар суспензиясын алу

Клеткаларды сұйық қорекгік ортада өсіру

Сұйық ортада өсірілетін клеткаларды клеткалар суспензиясы деп атайды. Сұйық орта ішінде клеткалар батпай, жүзген күйде тіршілік етуі үшін оларды аппаратпен үзбей араластыру керек. Тоқтамай айналу, шайқалу немесе сұйық орта арқылы стерильді ауаны үрлеу арқасында клеткалар оттегімен қамтамасыз етіледі. Мұндай жағдайда клеткаларды ауамен қамтамасыз ету едәуір жақсарады. Көбінесе сұйық ортаның құрамы агармен қатырған ортамен бірдей болады. Қатты ортада өсірген клеткалармен салыстырғанда суспензиядағы клеткалардың бірсыпыра артықшылығы бар. Клеткалар тіршілік ету үшін белгілі бір қолайлы жағдайларын қамтамасыз етуді қажет етеді. Міне осындай барлық клеткаларға біркелкі әсер ететін жағдай туғызу суспензиялық өсіру әдісімен жүзеге асырылады. Бұл әдістің тағы бір пайдалы жері - клеткалар өздері бөліп шығаратын зиянды метаболиттерден оңай арылады және де әр түрлі факторлардың бұл клеткалардың зат алмасу мен өсу процестеріне тигізетін әсерін отыру жеңілденеді. Суспензияда өсетін клеткалар биохимия және молекулалық биология тұрғысынан зерттеулер жүргізуге қолайлы келеді. Суспензиядан өз ерекшеліктері бар тұрақты клеткалық популяция алуға болады.

Клеткалар суспензиясын алу.

Әдетте, клеткалар суспензиясын алу үшін каллус ұлпасы пайдаланылады. Кейде экспланттың өзін сұйық ортаға салып өсіру арқылы да клеткалық суспензия алуға болады мысалы, тозаңқаптардан. Өсу кезінде экспланттың сыртында түзілген каллус клсткалары үзіліп түсіп сұйық ортаға шығады да, олардан суспензия пайда болады. Бірақ бұл ұзақ және тиімсіз процесс. Каллустан жеке клеткаларды ферменттік мацерациямен ыдыратып бөліп алуға да болады. Тек қана, мұндай жағдайда клеткалар зақымдануы мүмкін сондықтан, ұзақ уақыт тіршілік ете алмайды.

Сонымен, борпылдақ дифференцияланбаған каллусты сұйық ортаға салып шайқап өсіру, клеткалар суспензиясын шығарудың негізгі жолы. Борпылдақ каллусты өсіргенде қоректік ортаға 2,4 – Д қосады, ал цитокининнің мөлшерін азайтады немесе оны тіпті қоспайды. Тағы бір шарт - қоректік ортада кальций ионы болмауы керек, себебі ол кальций пектинатының түзілуіне әсер етеді. Кальций пектинаты клеткаларды өзара байланыстырып тұратын негізгі зат. Одан құтылу үшін каллусқа пектиназа ферментімен әсер ету керек.

Борпылдақ каллусты сұйық ортада жиі шайқап, араластырғанда ол жеке клеткаларға ыдырайды және кішігірім клеткалық агрегаттарға бөліне бастайды. Бөлінбей қалған тығыз каллустың қалдықтарын және ірі агрегаттарды 1-2 қабат дәке немесе нейлон арқылы сүзіп алып тастайды. Немесе суспензияны бірнеше минут қозғалтпай қойьш, оны тұндырып, үстіңгі жағында батпай қалған жеке клеткалар мен майда клетка топтарын бөлек құйып алады. Суспензияның үстіңгі жағындағы жеңіл фракциясын жаңа ортаға жиі-жиі көшіріп өсірсе, жеке клеткалардың саны көбейеді. Оған қоректік ортаның құрамы, аэрация және араластыру әдістері де әсер етеді. Бірақ қанша күш салғанмен, тек біркелкі жеке клеткалардан тұратын суспензияны алу мүмкін емес. Ең жақсы деген суспензияда жеке клеткалар үлесі 50~60%-тен аспайды, қалғаны 2-10 клеткадан тұратын, тіпті одан да көп клеткалар топтасқан агрегаттар болады. Өте ірі агрегаттардың сыртқы қабатындағы клеткалары мен ішкі жағында орналасқан клеткаларының қоректену және аэрация жағдайлары өзгеше болатындығын ескерген жөн,

Жеке клеткалары көп, яғни жақсы дисперленген суспензияны алу мақсатымен көбінесе қоректік ортаның құрамын бақылауға тырысады. Бар мәліметтер бойынша, ауксиндер клеткалардың бір-бірімен жабыспауына, жеке-дара болуына (диссоциациялануына) дұрыс әсер етеді, ал цитикининдер, керісінше, ол процесті тежейді. Демек, клеткалардың созылып өсуіне қолайлы және олардың бөлінуін тежейтін жағдайлар суспензиядағы клеткалар топтарының барынша бөлшектеніп, майдалануына мүмкіндік туғызады. Қоректік ортадағы көмірсулар клетканың сыртқы қабығындағы полисахаридтердің құрамын өзгерту арқылы клеткааралық байланыстарға әсер етуі мүмкін. Мысалы, қоректік ортаға галактоза, рафиноза немесе сахароза қосылғанда раушангүл суспензиясындағы клеткалар оңай топтасып, өте ірі агрегаттар құрған. Клетка қабығындағы целлюлозаны ыдырататын ферменттер (целлюлаза, мацерозим) осмотикпен бірге қосылып әсер еткенде суспензиядағы клеткалардың диссоциациялануы арта түседі.

Мүлде жеке клеткалардан тұратын суспензияны өсіру қаншама тартымды да, қызығарлықтай болса да, бұл мақсатқа жету биология тұрғысынан алып қарағанда өсімдік клеткалары үшін тіпті мүмкін емес. Себебі, тек жеке клеткалардан тұратын суспензия алу үшін клеткалар бөліне сала бір-бірінен тез ажырап кетуі қажет. Бірақ бұл өсімдік клеткасына тән қасиет емес, сондықтан оны жасанды жағдайда іске асыру қиынға соғады. Жақсы суспензияда морфология жағынан біркелкі, шағын көлемді клеткалар ұсақ агрегаттарға бірігіп топтасады (шамамен 10 клеткалы топтар). Қарқынды өсуді қамтамасыз ету үшін суспензияда клеткалардың тығыздығы бір миллилитр ортада 10⁵ – 10⁶ клетка болуы қажет.

Сұйық ортада өскен клеткаларды, алғашқы каллусқа қарағанда, жиірек жаңа қоректік ортаға көшіреді. Жаңа қоректік ортаға көшіретін суспензияның бөлігін инокулюм деп атайды. Оны стерильденген пипеткалармен, шприцтермен немесе, жоғарыда айтылғандай, суспензияны тұндырып, оның үстіңгі жағындағы батпай қалған клеткаларды іркіп құйып алады.