Бактериологическое исследование

Для исследованияв лабораторию направляют труп животного целиком или наиболее пораженные отрезки тонкого отдела кишечника (с содержимым), перевязанные с обоих концов, а также часть печени, селезенку и почку, экссудат брюшной полости, отечной подкожной клетчатки, трубчатую кость, мезентериальные лимфоузлы. Патматериал берут не позже 3-4 часов после гибели животного. От больного животного для исследования направляют фекалии (150-200г).

Микроскопическое исследование исходного материала. Из мукозы кишечника, органов готовят мазки, окрашивают по Граму. При микроскопии в положительных случаях находят крупные, короткие (0,6- 0,8х 1,2-4 мкм) со слегка закругленными концами, грамположительные, палочковидные клетки, имеющие капсулу. Необходимо принимать во вни­мание наличие С. perfringens в кишечнике клинически здоровых животных.

Обнаружение токсина в исследуемом материале. Объектом исследования является содержимое тонкого отдела кишечни­ка. Результат исследования зависит от времени исследования после смерти животного, так как токсины возбудителя лабильны. В идеале исследова­ние должно быть начато в пределах 30 минут после взятия материала и, во всяком случае, не позднее 3-4 часов. Токсические субстанции С. perfringens представлены в таблице 85. Содержимое кишеч­ника суспендируют в равном объеме стерильного физиологического раство­ра, встряхивают, центрифугируют для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость можно обрабатывать пенициллином и стрептомици­ном для подавления микрофлоры. Надосадочную жидкость целесообразно стерилизовать фильтрацией через мембранные фильтры. Наличие муцина затрудняет фильтрацию. В соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике инфекционной энтеротоксемии животных и ана­эробной дизентерии ягнят» (1984) содержимое кишечника после разведе­ния физиологическим раствором рекомендуется вьщерживать при 20-22° С 1 час, фильтровать через ватно-марлевый фильтр и центрифугировать при 3-5 тыс. об/мин в течение 20 минут.

Обнаружение токсинов. Фильтрат в объеме 0,4 мл вводят внутривенно двум мышам. У мышей в положительном случае в течение пяти минут возможно развитие шока, ле­тальный исход в течение 10 часов. Согласно «Методичес­ким указаниям...» в лабораториях РФ наличие токсина рекомен­дуется выявлять введением 0,5 мл фильтрата внутривенно или внутрибрюшинно двум белым мышам массой 16-18г или 1,0-1,5 мл кролику массой 1,8-2,0 кг с наблюдением за животными в течение 12 часов. При более по­здней гибели, особенно если материал не подвергали стерилизации, необхо­димо бактериологически исследовать трупы животных, чтобы исключить сопутствующую инфекцию. Экспресс-индикацию токсина в фекалиях про­водят в ИФА РНГА, латекс-агглютинацю, но в РФ чаше используют РН.

Токсические субстанции (а, β, έ, i) С. perfringens различных
типов (А, В, С, D, Е)

а -токсин - лецитиназа (фосфолипаза), разрушает мембрану клеток, вызывавает

(альфа-токсин) на кровяном агаре зону неполного гемолиза

(β -токсин - обладает летальным и некротизирующим действием, легко разрушается

(бета-токсин)

έ -токсин - выделяется как протоксин, активизируется в кишечнике под

(эпсилон-токсин) влиянием протеаз

i -токсин - выделяется как протоксин, активизируется трипсином, обладает

(йота-токсин) летальным и некротизирующим действием

Идентификация токсинов С. perfringens. После обнаружения токсина его идентифицируют в реакции нейт­рализации во внутрикожном тесте на морских свинках альбиносах или внутривенном (внутрибрюшинном) на белых мышах. Тест на мышах считается менее информативным, так как его результаты более под­вержены неспецифическим воздействиям.

Внутрикожный тест па морских свинках. Смешивают 0,5 мл ток­сического материала с 0,2 мл питательного бульона и 0,1 мл антиток­сической сыворотки. Общий объем должен составлять 0,8 мл. Если сме­шивают более чем одну сыворотку, то уменьшают количество бульона при сохранении общего объема смеси 0,8 мл. Аналогичные смеси готовят с трипсинизированным фильтратом: в фильтрат добавляют 1% трипсина (Дифко 1:250) и вы­держивают один час при 37° С. Трипсин активирует эпсилон-прото-ксин и разрушает бета-токсин. Смесь инъецируют внутрикожно морс­ким свинкам в объеме 0,2 мл. Реакцию учитывают через 24 и 48 часов (табл. 47).

Тест нейтрализации на мышах. Смеси готовят так же, как для тес­та на морских свинках, и инъецируют двум мышам. Результат учиты­вают в течение трех дней. О наличии или отсутствии токсина судят по смерти или выживанию животных. При наличии токсина в доста­точном количестве смерть обычно наступает в течение 10 часов. Схе­ма постановки реакции нейтрализации представлена в таблице 54.

Таблица 54 - Схема постановки реакции нейтрализации на