Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Для постановки РМА
Культуры лептоспир, используемые в качестве антигенов при определении этиологической структуры и обследовании импортируемого скота приведены в таблице 52. В хозяйствах с установленной этиологией и при транспортировке животных в пределах страны используют культуры серогрупп Pomona, Tarassovi, Canicola, Hebdomadis, Sejoroe, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae. Сыворотки крови исследуют в разведениях 1:100, 1:500, 1:2500 с учетом объема антигена, при необходимости определяют предельный титр. Разведенную сыворотку на 0,85%-ном растворе натрия хлорида разливают по 0,1 мл в различное количество лунок планшеты в зависимости от числа используемых антигенов. Затем в лунки вносят по 0,1 мл антигена. Контролем является культура лептоспир + физиологический раствор (агглютинации не должно быть). Компоненты перемешивают встряхиванием, выдерживают час при 30 -37°С, затем учитывают результат путем микроскопии препарата из содержимого каждой лунки при увеличении 20x10. Капли не покрывают покровным стеклом и наносят на предметное стекло бактериологической петлей диаметром 3 мм. Результат оценивают по следующим критериям: (+ + + +) — агглютинированы 100% лептоспир; (+ + +) — агглютинированы 75% лептоспир; (+ +) — агглютинированы 50% лептоспир; (+) — агглютинированы 25% лептоспир; (—) — агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в образовании конгломератов из 3-5 до нескольких десятков лептоспир при возможном лизисе клеток в малых разведениях сыворотки. Как положительный результат оценивают агглютинацию минимум на 2 креста. Животных с титром РМА 1:50 у невакцинированных, 1:100 и выше у вакцинированных оценивают как зараженных или возможных лептоспироносителей. Если в РМА при однократном исследовании реагирует положительно более чем 20% обследованных животных, то хозяйство признают неблагополучным по лептоспирозу. Положительные реакции с антителами Autumnalis, Cynopteri, Bataviae, Pyrogenes, Australis рассматривают как серогрупповые, поскольку лептоспиры указанных серогрупп обычно у сельскохозяйсгвенньк животных не обнаруживаются. Их признают возбудителями только в случае выделения чистой культуры или положительной РМА. Возбудителями лептоспироза признаются лептоспиры серогруппы, к которой антитела выявлены в большем титре. При положительной РМА с лептоспирами необычных серогрупп проводят повторное исследование животных через 10-12 суток в РМА. В США титр РМА 1:100 рассматривают как основание для подозрения в заболевании животного, 1:200 и более — как положительный результат, 1:800 и более — как показатель активной инфекции. При получении равных титров сыворотки с лептоспирами нескольких серогрупп или высоких титров к лептоспирам, ранее неизвестным как возбудители у с/х животных, для выяснения их этиологической роли прибегают к иммуноадсорбционному анализу. Техника иммуно-адсорбционного анализа изложена ранее применительно к серологической идентификации выделенных культур лептоспир. В качестве адсорбента применяют 5-7-суточные культуры, выращенные в жидкой питательной среде, инактивированные 0,3%-ным формалином в течение 10-12 часов, осажденные центрифугированием в течение 30 минут при 10000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0,9 мл физиологического раствора, смешивают с 0,1 мл исследуемой сыворотки, выдерживают 48 часов при 1-5°С, центрифугируют, надосадочную жидкость (адсорбированную сыворотку) исследуют на наличие антител к штамму-сорбенту, а далее исследуют со всеми штаммами в РМА, с которыми сыворотка реагировала до адсорбции. Антитела к возбудителю из сыворотки при абсорбции гетерологичными лептоспирами не удаляются. Питательные среды для культивирования лептоспир. Фосфатные буферные растворы. Маточные растворы: а). КН2Р04 — 9,078 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды; б). Na2HP04x 2Н20 — 11,876 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Растворы хранят при 2 -4°С до 30 суток. Рабочий буферный раствор готовят следующим образом: 79 мл раствора Б смешивают с 21 мл раствора А и 900 мл дистиллированной воды. Контролируют рН буфера и в случае необходимости подкисляют однозамещенным фосфорнокислым калием или подщелачивают двузамещенным фосфорнокислым натрием до рН 7,2 -7,4. Готовый раствор стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. Водно-сывороточная среда. Разлитый во флаконы фосфатный буферный раствор (рН 7,2 -7,4) автоклавируют при 115°С 30 минут. К охлажденному буферному раствору добавляют 5 -10% инактивированной при 56 -58°С в течение 1 часа сыворотки крови кролика или барана, фильтруют через фильтр Зейтца и разливают в пробирки. Для проверки на стерильность среду выдерживают при 37° С в течение 3 -5 суток. Среда Ферворта в модификации W. Wolff. 1). Растворяют 1 г пептона в 1 л дистиллированной воды и кипятят. 2). Добавляют 200 мл раствора Рингера и вновь кипятят. 3). Добавляют 100 мл фосфатного буфера рН 7,2 и кипятят. 4). Добавляют N-раствор фосфорной кислоты (2 мл). 8). Инактивируют 30 минут при 56°С в водяной бане. 9). Проверяют стерильность: выдерживают среду в термостате при 37° С в течение 24 часов. Полужидкая среда Флетчера. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 2 г агара и кипятят К) минут. Затем разливают по 5 мл в пробирки и автоклавируют при 0,8 атм 30 минут. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,5 мл стерильной сыворотки крови кролика или барана, инактивируют при 56-58° С 30 минут. Проверяют на стерильность в течение 3 -5 суток при 37°С. Среда Кортхофа. Бидистиллированной воды — 500 мл, пептона Витте — 400 мг, натрия Хлорида — 700 мг, NaHC03 — 10 мг, калия хлорида — 20 мг, кальция хлорида — 20 мг, КН2Р04 — 90 мг, Na2HP04x 2Н20 — 480 мг. Раствор прогревают 20 минут при 100°С, фильтруют через бумажный фильтр, прогревают в течение 30 минут при 100°С. После охлаждения добавляют 8% свежей кроличьей сыворотки. Разливают в пробирки по 8 мл. Прогревают в водяной бане при 56° С в течение 1 часа. Среда Стюарта. D-аспарагина (М/10) — 2 мл, Н4С1 (М/10) — 10 мл, MgCl2 (М/10) — 4 мл, NaCl (М/10) — 66 мл, глицерина — 1 мл, водного раствора фенола красного (0,02%) — 10 мл, дистиллированной воды — 91 мл. Смесь кипятят 30 минут, добавляют 16 мл фосфатного буфера (рН 7,6) и вновь прогревают при 100°С в течение 1 часа. Охлаждают и добавляют 5- 10% стерильной кроличьей сыворотки. Разливают асептично в пробирки по 4-5 мл в каждую и прогревают в водяной бане при 60°С в течение 1 часа. Цветная питательная среда для определения ферментации углеводов по А.С. Самедову. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,7 мг 10% экстракта пекарских дрожжей и раствор стерилизуют в течение 20 минут в автоклаве. Затем к этой смеси добавляют 250 г одного из углеводов и устанавливают рН 7,0-7,2. После этого добавляют 1 мл реактива Андреде. Готовую среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 3-5 мл и вторично стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 минут. Перед посевом лептоспир в эту среду добавляют инактивированную кроличью сыворотку из расчета 5% к объему среды (рН среды 7,4-7,6). Посевы заливают вазелиновым маслом. В случае ферментации углеводов среда окрашивается в светло-малиновый цвет. Плотная среда Кокс. В90 мл дистиллированной воды растворяют 1 г агара Дифко, 0,2 г триптозофосфатного бульона Дифко, автоклавируют, охлаждают до 50°С, добавляют 10 мл стерильной сыворотки крови кролика и 1 мл 5 -10%-ного раствора гемоглобина. Раствор гемоглобина готовят путем лизиса одного объема эритроцитов в 20 объемах дистиллированной воды и фильтрования через фильтр Зейтца. В среде устанавливают рН 7,5; прогревают в водяной бане при 56°С 30 минут, разливают ее в чашки Петри. Среда Канарейкиной С.К. и Черкулан П. В 90 мл дистиллированной воды растворяют 50 мл натрия хлорида, 1 г агара Дифко, 2,4 мл триптического перевара Хоттингера. Смесь кипятят 3-5 минут, добавляют 10 мл фосфатной смеси (см. выше), вновь кипятят, устанавливают рН, автоклавируют при 120°С в течение 15 минут. Далее смесь охлаждают до 50°С, добавляют 10 мл инактивированной кроличьей сыворотки и 5-10% гемоглобина (см. выше). Среда Еллингаузена и Куллода. Раствор «а»: Н4С1 — 5,35 г, MgCl6KH20 — 3,72 г, NaCl — 38,50 г, дистиллированная вода — 1л; раствор «б»: Na2HP04 — 16,6 г, КН2Р04 — 2,172 г, дистиллированная вода — 1 л. К 700 мл дистиллированной воды добавляют 50 мл раствора «а» и 40 мл раствора «б». Затем добавляют L-цистин — 180 мг, ZnSО4 — 3,2 мг, CuSО4 x 5Н2О — 2,4 мг, FeSО4 х 7Н20 — 40 мг. Смесь встряхивают и фильтруют. Вносят витамин В12 — 160 гамм и тиамин-НС1 —160 гамм. Добавляют дистиллированной воды до окончательного объема среды (1 л). Затем раствор стерилизуют при 121°С 15 минут. После охлаждения добавляют 20%-ный олеино-альбуминовый комплекс (ОАС) — 1% к объему среды. Он может быть заменен V фракцией бычьего альбумина (1%) и твином-80 (0,1%).
|