Сапрофитических видов лептоспир

Серологическая идентификация лептосп ир. Выделенные штаммы первоначально идентифицируют в реакции микроагглютинации на уровне серологических групп, а далее в пределах уста­новленной серогруппы определяют серовар. Техника постановки реакции микроагглютинации при определении серогрупповой принадлежности леп­тоспир изложена в соответствии с «Методическими указаниями по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток». Реакцию применяют для контроля диагностических штаммов лептоспир с сыворотками первого набора и выделенных штаммов с сыво­ротками второго набора. В качестве агглютиногена используют живые 5-10-суточные культуры в жидких питательных средах с накоплением 70-100 лептоспир в поле при увеличении 20x10x1,5.

В России применяют групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворот­ки в виде двух наборов (1-й: серогруппы Гриппотифоза, Помона, Иктерогеморрагия, Каникола, Тарассови, Батавия, Гебдомадис, Сейро, Мини, Пирогенес, Лутумпалис, Баллум, Аустралис, Яваника, Циноптери; 2-й: вышеперечисленные сыворотки, а также Целледони, Панама, Андамана, Семаранга, Шермани).

На физиологическом растворе готовят разведения диагностической сы­воротки 1:50, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16 000, 1:32 000. К 0,1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 0,1 мл исследуемой куль­туры. Контроль: 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл культуры леп­тоспир. Смесь компонентов выдерживают при 30-37°С в течение часа.

Результат учитывают путем темнопольной микроскопии препарата «раз­давленная капля». Оценку проводят в крестах: + + + + —агглютинирова­ны 100% клеток, + + + — агглютинированы 75% клеток, + + — агглютини­рованы 50% клеток, + — агглютинированы 25% клеток, (-) — агглютина­ция отсутствует. Исследуемую культуру относят к серологической группе лептоспир, с сывороткой против которой она дает реакцию на два-четыре креста до 50-100% ее титра.

После установления серогрупповой принадлежности штамма проводят аналогичное исследование со штаммами и антисыворотками к ним, пред­ставляющими все серотипы данной серогруппы.

Если в РМА не удается получить четких указаний на принадлежность штамма к определенному серовару, то применяют реакцию перекрестной адсорбции.

Техника иммуно-адсорбционного анализа. Необходимо приготовить им­мунную сыворотку на изучаемый штамм. С этой целью проводят гиперим­мунизацию кроликов внутривенно изучаемой культурой лептоспир, содер­жащей 70-100 клеток в поле зрения (х 400) по схеме 1,2 и 2 мл с интерва­лом в трое суток и 3 мл с интервалом в пять суток. На девятые сутки после заключительной инъекции пробы сыворотки крови исследуют в РМА, тит­ры обычно составляют 1:30 000 и более. Для стандартизации условий опы­та иммунные сыворотки разводят до получения единого титра — 1:3000 (в РМА с формалинизированным антигеном) при интенсивности реакции в этом титре не более чем два креста.

При получении антигенов лептоспиры культивируют во флаконах ем­костью 100-250 мл со средой Ферворта-Вольфа при 30° С в течение 4-7 суток до накопления 80-150 микробных клеток в поле зрения (х 400). Леп­тоспиры инактивируют формалином (0,5%), осаждают центрифугировани­ем (10 000 об/мин, 20 минут), затем осадок из флаконов объединяют и цент­рифугируют повторно (10 000 об/мин, 10 минут). К осадку лептоспир, полу­ченному из 100 мл исходной культуры, добавляют 0,1 мл физиологическо­го раствора, суспендируют и добавляют еще 0,8 мл физиологического ра­створа. В этот объем антигена вносят 0,1 мл антисыворотки со стандарт­ным титром (1:3000). Стаканы со смесью компонентов, во избежание испа­рения жидкости, закрывают резиновыми пробками и выдерживают при 37°С или при 2-3°С в течение 24 часов. Далее смесь центрифугируют (10 000 об/мин, 10 минут), надосадочную жидкость осторожно (не взмучивать!) отсасыва­ют. Она представляет из себя адсорбированную сыворотку. Эту сыворотку в разведении 1:30 проверяют в РМА с формалинизированной культурой-адсорбентом на наличие остаточных антител (антител не должно быть!). В случае необходимости адсорбцию повторяют. При отсутствии антител к лептоспире-адсорбенту сыворотку исследуют в РМА с гомологичными и гетерологичными антигенами. С указанной целью адсорбированную сыво­ротку разводят 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000, принимая во внимание, сыворотка в процессе адсорбции уже была разведена 1:10 (0,9 мл антигена + 0,1 антисыворотки). Титр стандартной сыворотки (1:3000) принимают за 100%. Соответственно в процентах выражают каждое разведение этой сыворотки и в виде процентов изображают результаты исследования. Если эталонный штамм полностью (или более чем на 90%) адсорбирует антитела из сыворотки против изучаемого штамма, то изучаемый штамм считают идентичным эталону. Серогруппу или серовар можно установить, используя моноклональные антитела соответствующей специфичности.

Возможна серологическая идентификация лептоспир методом флуоресцирующих антител в исследуемом материале или в культурах на уровне вида.

В нативном материале и в культуре лептоспиры можно идентифициро­вать на уровне вида, серогруппы и серовара при помощи ПЦР.

Биопроба. Проводят с целью выделения культур лептоспир из исследуемого материа­ла, определения патогенных свойств культуры или освобождения ее от по­сторонней микрофлоры.

Для заражения используют суспензию паренхиматозных органов (поч­ки, печень) от абортированных плодов, сперму, кровь, мочу. Кровь целесо­образно брать на стадии лихорадки. Позднее можно исследовать первую порцию утренней мочи. Паренхиматозные органы измельчают в ступке со стерильным физиологическим раствором, после отстаивания используют надосадочную жидкость. Любым материалом лабораторных животных за­ражают сразу же после его получения.

Заражают кроликов-сосунков (10-20-дневный возраст), молодых мор­ских свинок (масса не более 200 г), золотистых хомячков (20-30-дневный возраст), сусликов, белых и серых мышей. Крольчатам материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в дозе 2-3 мл, хомякам — 0,5-1,0 мл. Морские свинки наиболее чувствительны к лептоспирам Icterohaemorrhagiae, несколько меньше — к Pomona и малочувствительны к другим лептоспирам.

За животными наблюдают в течение 15 суток, в случае гибели под­вергают бактериологическому исследованию, при отсутствии гибели часть животных убивают и исследуют через 4-5 суток, остальных — через 14-16 суток. В последнем случае исследуют сыворотку крови, начиная с разведения 1:10 в РМА. Заключение о результатах биопробы делают на основании показаний серологической реакции.

Для проверки патогенных свойств выделенных лептоспир заражают раз­личными дозами (0,1-1,0 мл) 5-7-дневной бульонной культуры внутри брюшинно крольчат и золотистых хомячков (0,1-1,0 мл). Штаммы, вызы­вающие гибель животных от дозы 0,1 мл, оценивают как высоковирулент­ные, 1,0 — слабовирулентные.

Серологическая диагностика. Серологическую диагностику в основном осуществляют при помощи реак­ций микроагглютинации (РМА), иммуноадсорбции (РИА), ELISA.

Реакция микроагглютинации. В качестве антигенов используют 5-15-дневные живые культуры в жидкой питательной среде с накоплением 70-100 клеток в поле зрения при увеличении микроскопа 20x10x15, более густые — разводят питательной средой до указанной концентрации. Культуры определенных серогрупп лептоспир диагностическим лабораториям предоставляет Всероссийский научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертифи­кации ветеринарных препаратов.